一种荧光标记的32-plex InDels复合扩增系统及其应用技术方案

本发明专利技术属于生物学检测技术领域，尤其涉及一种荧光标记的32‑plex InDels复合扩增系统及其应用。本发明专利技术构建的复合扩增系统包括32个InDel位点和一个性别位点，选取了在中国汉族人群中最小等位基因频率(MAF)≥0.4的InDel标记，扩增片段范围从70bp到160bp。使用上述复合扩增系统对中国汉族204个无关个体进行基因分型，累积个人识别概率为0.999999999999966，累积非父排除概率为0.9982。研究表明，本发明专利技术构建的复合扩增系统对中国汉族人群具有高度识别能力，同时能对低至31.25pg的DNA模板正确分型，并对降解DNA的扩增分型有显著优势。

A Fluorescent Labeled 32-plex InDels Complex Amplification System and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种荧光标记的32-plexInDels复合扩增系统及其应用
本专利技术属于生物学检测
，尤其涉及一种荧光标记的32-plexInDels复合扩增系统及其应用，该复合扩增系统为包含32个插入缺失位点的复合扩增系统。
技术介绍
在法医遗传学领域，个人识别和亲子鉴定问题主要通过DNA遗传标记的基因分型来解决。短串联重复序列(STR)已经成为最常用的遗传标记，这是由于它们的高多态性和在不同国家人群中已知的等位基因频率数据。然而，STR扩增系统的扩增片段较长，面对高度降解的DNA样品分辨力低下，并且存在突变率高的缺陷。单核苷酸多态性(SNP)具有扩增子短、突变率低、人类基因组密度高的特点，弥补了STR的不足。然而，目前的SNP的分型技术复杂多样，限制了其在法医实验室的推广应用。插入/缺失多态性标记(InDels)是SNP标记的特殊类型，它结合了STR和SNP的优点。InDel在人类基因组中广泛分布，平均密度为每7.2kb一个InDel。InDel的扩增片段长度约在50-150bp，这意味着突变率较低，以及对小片段的DNA模板(如高度降解的DNA)有更好的分型效果。此外，与SNP相比，InDel的分析过程更为简化，更易于应用于实践。因此，InDel在司法实践中面临挑战性案件时发挥着重要作用。自InDel被发现以来，已有许多研究报道使用InDel构建复合扩增系统。根据已发表的研究，InDels已被应用于个人识别、亲子鉴定、祖先推断以及特殊检材的基因分型，如尸检材料、人类肿瘤组织、骨骼残骸和石蜡包埋组织。目前已有Investigator试剂盒(Qiagen，德国)可以一次扩增30个InDel标记和amelogenin性别位点。多个验证研究已经证明它对世界各地的许多人口都有较强的鉴别能力。然而研究表明，与欧洲人群相比，Investigator试剂盒对中国人群的识别力较低，而国内尚没有针对中国人开发的InDel商品化试剂盒。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种荧光标记的32-plexInDels复合扩增系统及其应用。本专利技术是这样实现的，一种荧光标记的32-plexInDels复合扩增系统，包括如下32个InDel标记和amelogenin性别位点的复合扩增引物：rs6481、Amelogen、rs2307976、rs35851958、rs3837647、rs2307433、rs3841948、rs35248926、rs71305406、rs34843628、rs10590424、rs3038530、rs2307561、rs1610905、rs5789826、rs1799734、rs2308292、rs2307930、rs16458、rs140397390、rs17515041、rs2307661、rs34511541、rs35149698、rs35605984、rs1160886、rs3042783、rs1611048、rs61124555、rs25552、rs2308189、rs199726575、rs2308112；所述32个InDel位点和一个性别位点的复合扩增引物序列见SEQIDNO:1-SEQIDNO:66。进一步，使用4种荧光素染料标记32个InDel位点和一个性别位点：6-FAM标记rs6481、rs2307976、rs35851958、rs3837647、rs2307433、rs3841948、rs35248926、rs71305406和Amelogen性别位点；VIC标记rs34843628、rs10590424、rs3038530、rs2307561、rs1610905、rs5789826、rs1799734、rs2308292；NED标记rs2307930、rs16458、rs140397390、rs17515041、rs2307661、rs34511541、rs35149698、rs35605984；PET标记rs1160886、rs3042783、rs1611048、rs61124555、rs25552、rs2308189、rs199726575、rs2308112。进一步，所述32个InDel标记和Amelogen标记可以在一个复合扩增体系中同时扩增。进一步，所述扩增系统PCR体系总体积为20μL，其中包含10μL的PCR反应缓冲液、4μL的引物混合物、1μL的2μg/μL的牛血清蛋白溶液和0.5ng基因组DNA，用无核酸水补充至20μL；所述引物混合物为权利要求1中所述引物的混合物。进一步，所述扩增系统PCR程序为：95℃预变性2min；95℃30s，60℃90s，72℃60s，共32个循环；60℃延伸30min。如权利要求1-5任一所述的一种荧光标记的32-plexInDels复合扩增系统在中国汉族法医鉴定中的应用。如权利要求1-5任一所述的一种荧光标记的32-plexInDels复合扩增系统在降解DNA分析检测中的应用。如权利要求1-5任一所述的一种荧光标记的32-plexInDels复合扩增系统在亲子鉴定中的应用。如权利要求1-5任一所述的一种荧光标记的32-plexInDels复合扩增系统在个体识别中的应用。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：本专利技术建立了一个由32个InDel遗传标记和amelogenin性别位点组成的复合扩增系统，选取了在中国汉族人群中最小等位基因频率(MAF)≥0.4的InDel标记，所有的InDel标记在一个简单的PCR系统中被扩增，其扩增片段长度从70bp到160bp不等。本专利技术在204个中国汉族无关个体间对该InDel复合扩增系统进行了评估。所有的InDel标记均被证明具有高度多态性，平均观测杂合度(Hobs)为0.4885。累计个人识别概率(CPD)和累计非父排除概率(CPE)分别为0.99999999999996和0.9982。进一步的验证研究表明，32-plexInDels复合扩增系统能对低至31.25pg的DNA模板进行正确分型，并对降解DNA的扩增分型有显著优势。附图说明图1是0.5ng某男性DNA模板的毛细管电泳分型图谱；图2是使用32-plexInDels复合扩增系统对不同浓度梯度的DNA9947A扩增得到的分型图谱；DNA浓度从250pg到15.625pg；图3是使用EX22STR试剂盒对降解DNA进行扩增分型所得图谱；图4是使用本32-plexInDels复合扩增系统对降解DNA进行扩增分型所得图谱；图5是使用32-plexInDels复合扩增系统对五种动物进行检验，从上至下分别是鸡、兔、牛、猪和鼠。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术披露了一种荧光标记的32-plexInDels复合扩增系统及其应用，具体如下各实施例所示。实施例1构建32-plexInDels复合扩增系统1.DNA样本共采集204例中国南方汉族无关个体的口腔拭子或血样，其中女性78例，男性126例。采用Chelex-100法提取基因组DNA。使用Nanodrop2000分光光度计(Thermo本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光标记的32‑plex InDels复合扩增系统，其特征在于：包括如下32个InDel标记和amelogenin性别位点的复合扩增引物：rs6481、Amelogen、rs2307976、rs35851958、rs3837647、rs2307433、rs3841948、rs35248926、rs71305406、rs34843628、rs10590424、rs3038530、rs2307561、rs1610905、rs5789826、rs1799734、rs2308292、rs2307930、rs16458、rs140397390、rs17515041、rs2307661、rs34511541、rs35149698、rs35605984、rs1160886、rs3042783、rs1611048、rs61124555、rs25552、rs2308189、rs199726575、rs2308112；所述32个InDel位点和一个性别位点的复合扩增引物序列见SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:66。

【技术特征摘要】
1.一种荧光标记的32-plexInDels复合扩增系统，其特征在于：包括如下32个InDel标记和amelogenin性别位点的复合扩增引物：rs6481、Amelogen、rs2307976、rs35851958、rs3837647、rs2307433、rs3841948、rs35248926、rs71305406、rs34843628、rs10590424、rs3038530、rs2307561、rs1610905、rs5789826、rs1799734、rs2308292、rs2307930、rs16458、rs140397390、rs17515041、rs2307661、rs34511541、rs35149698、rs35605984、rs1160886、rs3042783、rs1611048、rs61124555、rs25552、rs2308189、rs199726575、rs2308112；所述32个InDel位点和一个性别位点的复合扩增引物序列见SEQIDNO:1-SEQIDNO:66。2.根据权利要求1所述的一种荧光标记的32-plexInDels复合扩增系统，其特征在于：使用4种荧光素染料标记32个InDel位点和一个性别位点：6-FAM标记rs6481、rs2307976、rs35851958、rs3837647、rs2307433、rs3841948、rs35248926、rs71305406和Amelogen性别位点；VIC标记rs34843628、rs10590424、rs3038530、rs2307561、rs1610905、rs5789826、rs1799734、rs2308292；NED标记rs2307...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄代新，黄钰洁，刘聪，肖超，易少华，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42