鉴定奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交子代的方法、试剂盒及应用技术

本发明专利技术公开了鉴定奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交子代的方法、试剂盒及应用，所述方法采用SNP标记引物对待测罗非鱼样品进行鉴定，从而获得一种能够有效用于罗非鱼的种质鉴定，进而开展分子标记辅助育种，实现短时间、低成本、高准确率的保种、选育工作。与现有技术相比，本发明专利技术具有以下优点：(1)本发明专利技术所述方法提供的SNP标记引物不受罗非鱼年龄、性别及养殖状态限制，可以用于罗非鱼早期种质鉴定，显著提升罗非鱼的保种、选育工作效率；(2)本发明专利技术所述方法选取罗非鱼GH外显子基因上的SNP位点作为检测位点，对解释罗非鱼生长速率差异可杂交优势等分子标记辅助育种提供了科学依据。

Method, Kit and Application of Identification of Oreochromis aureus, Nile tilapia and Their Hybrid Progenies

【技术实现步骤摘要】
鉴定奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交子代的方法、试剂盒及应用
本专利技术属于分子育种
，涉及一种分子标记辅助育种的方法，具体为鉴定奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交子代的方法、试剂盒及应用。
技术介绍
罗非鱼原产于非洲，具有生长速度快、食性杂、鱼肉无肌间刺、抗逆性强等诸多优点，深受世界各国水产养殖业者的喜爱，是FAO推荐养殖鱼类。作为外来养殖鱼类，罗非鱼自上世纪80年代以来引进我国，得到了快速的发展，我国目前已形成一条包括苗种繁育、健康养殖、营养与饲料、疾病防控、加工运输等诸多关键环节的完整产业链，罗非鱼产量和出口量已多年雄踞世界第一位。优良的罗非鱼苗种是罗非鱼养殖成功的首要环节，也是保证成鱼品质的关键，因此罗非鱼苗种繁育以及优良性状的罗非鱼亲本选择环节至关重要。目前国内主要有奥尼罗非鱼、吉富罗非鱼、吉奥罗非鱼等品种，其中吉富罗非鱼采用的是家系选育方法，而奥尼罗非鱼和吉奥罗非鱼分别是以奥利亚罗非鱼为父本、尼罗罗非鱼和吉富罗非鱼为母本杂交形成的高雄性率子代。而奥尼罗非鱼和吉奥罗非鱼的雄性率和生长性状常常取决于父本与母本的种质纯度，而吉富的家系选育也要求对亲本的遗传背景清晰，这就要求在生产过程中严格保证不同罗非鱼品种不能种间混杂。然而在生产实践中由于种间外形类似且种间无生殖隔离，操作不生常常引起品种混杂，降低种质纯度，导致生产的苗种经济性状退化，进而影响罗非鱼养殖效益，制约产业健康发展。随着分子生物学技术的发展，通过分子标记鉴定罗非鱼不同品种已成为一种可能，目前通过微卫星和AFLP技术来建立不同品种鉴定的鉴定标记已有不少研究，但由于以上两种分子技术主要集中在非编码区，对不同品种间的遗传差异的生物学解释仍不够明确，因此，从功能基因编码区开发鉴别不同品种间的差异的应用技术成为未来的水产育种的一种趋势。中国专利CN201210384347.1公开了一种鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼的方法，所述方法采用PCR扩增后对产物进行电泳，并通过电泳结果判断鉴定结果。所述方法有助于快速、准确鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼，在罗非鱼种质鉴定、保种和选育中有极大的应用价值。但在实际操作中由于电泳和染色等操作需要专业的操作技能，且电泳和染色的复杂性可能导致部分差异性标记未能及时检出，对分析结果造成干扰，因此，有必要进一步提高鉴别技术的操作简便性和稳定性，达到有效分离奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼和杂交子代的目标。
技术实现思路
解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，获得一种能够有效用于罗非鱼的种质鉴定，进而开展分子标记辅助育种，实现短时间、低成本、高准确率的保种、选育工作，本专利技术提供了鉴定奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交子代的方法、试剂盒及应用。技术方案：鉴定奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交子代的方法，所述方法包括以下步骤：(1)采集待鉴定的罗非鱼样品，提取基因组DNA；(2)采用SNP标记引物扩增步骤(1)提取的基因组DNA；(3)将步骤(2)所得PCR扩增片段采用直行Sanger测序，获得扩增片段基因序列，使用ContigExpress软件对测序结果进行拼接，使用Bioedit进行批量序列对比，找到一个在三种罗非鱼中产生群体差异的SNP位点。优选的，步骤(2)中所述的SNP标记引物为：上游引物、SEQIDNO:2，5’-TGTCACGTTTCTCCTGATGAATTTA-3’；下游引物、SEQIDNO:3，5’-TCCTGAGATTATAGCTGACTGTCAT-3’。优选的，步骤(3)中所得PCR扩增片段为SEQIDNO:1：TGTCACGTTTCTCCTGATGAATTTAAACATCTAGTTTTCAACTATAAAAGCAAAAACTCTGAGCTGAAAACATCAGAACCACCGACTCACATCATAATCATCTGAGCCGCAAACAGAGCCTGAACTGATGCCAGCCATGAACTCAGGTAAGACATCTGGGCTCCCCCACGAGAAGGGACCACTGCTTTATGATGTTTAACAAAGTCTGAAACTGTCTGTCTGTCTGTCTGTCTGTCTGTCAGTCGTCCTCCTGCTGTCGGTTGTGTGTTTGGGCGCCTCCTCTCAGCAGATCACAGACAGCCAGCGTTTGTTCTCCATTGCAGTCAACAGAGTCACGCACCTGCACCTGCTCGCCCAGAGACTCTTCTCGGACTTTGTAAGCCTGCAGCAGCTCAACAATCTTTCTTCTTTCTGAAAAAGACCAAATGTTACCTAAATCAAAGCTAATGCACAGGACAGAAACTAGGTTCAAAATACGTTCAACAAAATGTTCTGGATATTCAGTGTGTGCAGTGAGTTTAGATGCACACAGACATATGGACACATTTCACATTTGATGTCAAGGGAACCGAGACACTTTGTAGACTGTCACTGCTAAAAACACAGCAGACGTTTACACTTTACATTTTAATGACAGTCAGCTATAATCTCAGGA优选的，步骤(3)中三种罗非鱼中产生群体差异的SNP位点位于扩增片段5’端起第276位碱基上，其中奥利亚罗非鱼为CC基因型，尼罗罗非鱼为TT基因型，奥尼罗非鱼为TC基因型。含有步骤(2)所述SNP标记引物的试剂盒。以上所述的试剂盒在罗非鱼保种、选育中的应用。本专利技术所述方法的原理在于：奥利亚罗非鱼与尼罗罗非鱼体型相似，但两个群体间的生长速度有明显差异。研究发现，下丘脑垂体生长轴上GH-IGF通路与罗非鱼的生长状况密切相关，而上游基因生长激素(growthhormone,GH)在通路中起到决定性作用。本实验以GH基因为目标基因，通过对两种罗非鱼及其杂交子代GH基因组编码区片段进行扩增、测序及对比分析，寻找三个群体GH基因组碱基序列差异。实验发现，在GH基因第二外显子第34位碱基(5’端起第276位碱基)上，奥利亚罗非鱼表现为纯合子CC，编码氨基酸为丙氨酸，尼罗罗非鱼表现为纯合子TT，编码氨基酸为缬氨酸，而其杂交子代表现为杂合子TC，两种氨基酸在功能及三维构型上存在明显差异。因此，通过对GH基因组序列5’端起第276位碱基进行碱基序列分析，可对奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交子代的鉴定工作做出明确指导。有益效果：(1)本专利技术所述方法提供的SNP标记引物不受罗非鱼年龄、性别及养殖状态限制，可以用于罗非鱼早期种质鉴定，显著提升罗非鱼的保种、选育工作效率；(2)本专利技术所述方法选取罗非鱼GH外显子基因上的SNP位点作为检测位点，对解释罗非鱼生长速率差异可杂交优势等分子标记辅助育种提供了科学依据。附图说明图1是实施例1中奥利亚罗非鱼的部分测序峰图；图2是实施例1中尼罗罗非鱼的部分测序峰图；图3是实施例1中奥尼罗非鱼的部分测序峰图。具体实施方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1鉴定奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.鉴定奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交子代的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)采集待鉴定的罗非鱼样品，提取基因组DNA；(2)采用SNP标记引物扩增步骤(1)提取的基因组DNA；(3)将步骤(2)所得PCR扩增片段采用直行Sanger测序，获得扩增片段基因序列，使用Contig Express软件对测序结果进行拼接，使用Bioedit进行批量序列对比，找到一个在三种罗非鱼中产生群体差异的SNP位点。

【技术特征摘要】
1.鉴定奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交子代的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)采集待鉴定的罗非鱼样品，提取基因组DNA；(2)采用SNP标记引物扩增步骤(1)提取的基因组DNA；(3)将步骤(2)所得PCR扩增片段采用直行Sanger测序，获得扩增片段基因序列，使用ContigExpress软件对测序结果进行拼接，使用Bioedit进行批量序列对比，找到一个在三种罗非鱼中产生群体差异的SNP位点。2.根据权利要求1所述的鉴定奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交子代的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的SNP标记引物为：上游引物、SEQIDNO:2，5’-TGTCACGTTTCTCCTG...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖炜，杨弘，陈炳霖，邹芝英，李大宇，祝璟琳，喻杰，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：江苏,32