一种确山黑猪鉴定方法技术

本申请属于动物品种鉴定技术领域，具体涉及一种利用D‑loop区突变位点鉴定确山黑猪的方法。该方法包括：提取待鉴定猪品种样品的基因组DNA、PCR扩增、比对鉴定等步骤。具体鉴定时，如果第185位碱基为C或者第589位碱基为G，则待鉴定猪品种为与确山黑猪有遗传关系的确山黑猪品种。利用该鉴定方法，对于确山黑猪品种保护、品种培育以及市场开发都具有较好的实用价值。同时鉴于本申请的鉴定方法，与大规模的测序方法相比，具有操作简单、快速高效、成本低廉等优点，因此也可为其他地方性猪品种的保护鉴定、品种培育和市场开发提供较好的技术借鉴，因此具有较好的推广应用意义。

A method for identification of Queshan black pig

【技术实现步骤摘要】
一种确山黑猪鉴定方法
本申请属于动物品种鉴定
，具体涉及一种利用D-loop区突变位点鉴定确山黑猪的方法。
技术介绍
确山黑猪是一种地方性猪种，其主产区在河南省确山县，因产区交通不便，形成了自然隔离，后经当地劳动人民长期选育逐步形成适应当地饲养环境条件而形成了一个地方优良品种。因其具有肉质细嫩、颜色暗红、富含大理石纹，繁殖力强、适应能力强、性情温顺、易于调教等优良特点，因此是我国优良的畜禽遗传资源之一。优良猪种选育、培育的前提条件之一在于猪种的准确鉴定，常规猪种鉴定方式主要是结合原始产区、形态特征、肉质等方面进行鉴定，但是这种鉴定方式由于受生长特性影响，因此容易出现错误鉴定结果。而采用基因组分析鉴定虽然可以准确鉴定，但现有鉴定成本及技术复杂度，因此应用较为有限。线粒体DNA属于一种核外母系遗传体系，其具有完整传递与表达遗传信息的能力，且具有进化速度快、结构简单、保守性强等特点，因此常被用作动物鉴定的DNA条形码。已有研究认为，线粒体D-loop区是线粒体基因组上上进化速度最快的一个区域，因此常作为遗传分子标记区域用于亲缘关系较近的畜禽品种遗传多样性及群体遗传结构等方面的研究。已有研究表明，猪线粒体D-loop区基因全长1175bp（NCBIReferenceSequence：NC_000845.1），该段基因序列内无内含子，位于猪线粒体参考基因组（Sscrofa11.1）的1bp和1175bp之间。该D-loop区基因的二级结构在功能上分为三个功能区，分别为Ⅰ区、Ⅱ区和Ⅲ区，即高变区、串联重复区和保守区，每个功能区是一个单独的标准区域。现有技术虽然对于该D-loop区进行了较多研究，但由于确山黑猪研究较少，因此尚未见到利用该D-loop区来对确山黑猪进行鉴定的报道。
技术实现思路
本申请目的在于提供一种利用线粒体D-loop区突变位点鉴定确山黑猪的方法，从而较好解决不同地方黑猪品种在形态特征之间过于相似，而无法直接从外观判断品种归属的难题，进而为确山黑猪品种的准确鉴定及相关品种培育奠定一定技术基础。本申请所采取的技术方案详述如下。一种确山黑猪鉴定方法，该方法包括如下步骤：（1）提取待鉴定品种基因组DNA具体例如采用酚氯仿法进行提取；（2）设计引物基于第185位碱基序列进行判定时：在D-loop区基因第185位碱基的上游和下游设计PCR扩增用引物序列（如SEQIDNO.1~2所示）如下：上游引物185-F序列为5'-GTAGGTGCCTGCTTTCGT-3'，下游引物185-R序列为5'-CACCCTATAACGCCTTGC-3'；基于第589位碱基序列进行判定时：在D-loop区基因第589位碱基上、下游分别设计一条PCR引物（如SEQIDNO.3~4所示），具体如下：上游引物589-F序列为5'-GGCAAGGCGTTATAGGGT-3'，下游引物589-R序列为5'-ATACGGCACGACAATCCA-3'；（3）PCR扩增以步骤（1）中所提取基因组DNA为模板，利用步骤（2）所设计引物进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行电泳检测，并回收目标产物进行测序；PCR扩增时，25μl扩增体系可参考设计如下：步骤（1）中所提取模板基因组DNA，40ng；2×ESTaqMasterMix（例如采用康为世纪CW2214M产品），12.5μL；上游引物，10pmol；下游引物，10pmol；ddH2O，加至25μl；扩增条件为：预变性94℃、5min；变性94℃、30s，退火51.3℃、30s，延伸72℃、50s，25个循环；最后延伸72℃、10min；扩增目标长度为1175bp；对扩增产物可采用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测合格后再进一步进行测序分析；（4）比对鉴定将步骤（3）测序结果与现有NCBI中1175bp的猪D-loop区基因（NCBI登录号：NC_000845.1）进行比对，如果第185位碱基为C或者第589位碱基为G，则为与确山黑猪有遗传关系的确山黑猪品种（即，可以确定为纯种确山黑猪，或者为确山黑猪的杂交品种）。所述利用D-loop区突变位点鉴定确山黑猪的方法，可将确山黑猪与河南省其他地方品种（豫西黑猪、南阳黑猪、淮南猪）、中国地方猪种（槐猪、桃源猪、莱芜猪、金华猪、梅山猪、五指山猪、陆川猪、民猪、二花脸）、西方商业猪种（约克夏、杜洛克、长白）、东南亚地方猪种（Moncai、JNP）等进行准确区分。在对多个猪品种的线粒体基因组比对基础上，专利技术人确定了一种较为简便的鉴定确山黑猪品种的鉴定方法。利用该鉴定方法，对于确山黑猪品种保护、品种培育以及市场开发都具有较好的实用价值。同时鉴于本申请的鉴定方法，与大规模的测序方法相比，具有操作简单、快速高效、成本低廉等优点，因此也可为其他地方性猪品种的保护鉴定、品种培育和市场开发提供较好的技术借鉴，因此具有较好的推广应用意义。附图说明图1为实施例1中185位碱基所设计引物回收的PCR产物的测序结果图；图2为实施例1中589位碱基所设计引物回收的PCR产物的测序结果图；图3为确山黑猪和其他猪种D-loop区基因185位附近的对比图；图4为确山黑猪和其他猪种D-loop区基因589位附近的对比图。具体实施方式下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验材料、实验仪器等情况简要介绍说明如下。实验材料：确山黑猪：河南省确山黑猪保种场；河南省其他地方品种（豫西黑猪、南阳黑猪、淮南猪）、中国地方猪种（槐猪、桃源猪、莱芜猪、金华猪、梅山猪、五指山猪、陆川猪、民猪、二花脸）、西方商业猪种（约克夏、杜洛克、长白）、东南亚地方猪种（Moncai、JNP），均为可公开获得品种资源；部分样本具体来源为：南阳黑猪，河南省南阳黑猪保种场；豫西黑猪，河南省豫西黑猪保种场；淮南猪，河南省淮南猪原种场；引物由上海生工生物有限公司合成，测序由北京擎科新业生物技术有限公司完成；主要试剂：组织基因组DNA提取试剂盒（DP304），天根生化科技有限公司产品；主要仪器所使用PCR仪型号TCA0096，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。实施例1现有研究中，哺乳动物的线粒体DNA结构简单、稳定、遵循母系遗传，常作为一种遗传标记来研究家畜的起源进化、亲缘关系、群体遗传结构等。基于这一特点，专利技术人本专利技术通过扩增四个河南省地方猪（豫西黑猪、南阳黑猪、淮南猪）的线粒体基因组并进行比对，发现在D-loop区基因的185位上，确山黑猪存在一个特有突变g.185T突变为C；另外，在D-loop区基因的589位上，确山黑猪存在一个插入碱基G，基于此发现，专利技术人进一步就部分品种进行了进一步实验验证。具体过程介绍如下。（一）引物设计专利技术人在NCBI中选取猪D-loop区基因（登录号：NC_000845.1），在D-loop区基因第185位碱基上下游分别设计一条PCR引物，上游引物序列为5'-GTAGGTGCCTGCTTTCGT-3'，下游引物序列为5'-CACCCTATAACGCCTTGC-3'；在D-loop区基因第589位碱基上、下游分别设计一条PCR引物：上游引物序列为5'-GGCAAGGCGTTATAGGGT-3'，下游引物序列为5'-ATACGGCACGACA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.确山黑猪PCR鉴定用引物对，其特征在于，基于第185位碱基序列进行PCR鉴定时：PCR扩增用引物序列如SEQ ID NO.1~2所示，具体如下：上游引物185‑F：5'‑GTAGGTGCCTGCTTTCGT‑3'，下游引物185‑R：5'‑CACCCTATAACGCCTTGC‑3'；基于第589位碱基序列进行PCR鉴定时：PCR扩增用引物序列如SEQ ID NO.3~4所示，具体如下：上游引物589‑F：5'‑GGCAAGGCGTTATAGGGT‑3'，下游引物589‑R：5'‑ATACGGCACGACAATCCA‑3'。

【技术特征摘要】
1.确山黑猪PCR鉴定用引物对，其特征在于，基于第185位碱基序列进行PCR鉴定时：PCR扩增用引物序列如SEQIDNO.1~2所示，具体如下：上游引物185-F：5'-GTAGGTGCCTGCTTTCGT-3'，下游引物185-R：5'-CACCCTATAACGCCTTGC-3'；基于第589位碱基序列进行PCR鉴定时：PCR扩增用引物序列如SEQIDNO.3~4所示，具体如下：上游引物589-F：5'-GGCAAGGCGTTATAGGGT-3'，下游引物589-R：5'-ATACGGCACGACAATCCA-3'。2.利用权利要求1所述PCR鉴定用引物对的确山黑猪鉴定方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：（1）提取待鉴定猪品种样本基因组DNA；（2）PCR扩增以步骤（1）中所提取基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物对进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行测序；（3）比对鉴定将步骤（2）测序结果与现有NCBI中登录号：NC_000845.1的猪D-loop区基因进行比...

【专利技术属性】
技术研发人员：李新建，李秀领，薛亚辉，黄志伟，贺萌萌，
申请(专利权)人：河南农业大学，河南枫华种业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41