与藏绵羊耐低氧性能相关的遗传标记及其应用制造技术

本发明专利技术涉及动物分子育种学领域，公开了与藏绵羊耐低氧相关的遗传标记，其位于HMOX2基因上，存在等位基因A7、B7，当所述等位基因为A7、B7时，所述藏绵羊耐低氧性能良好。本发明专利技术公开的遗传标记能够用于鉴定藏绵羊耐低氧性能，还能够用于辅助选育耐低氧性能优秀的藏绵羊。

Genetic Markers Related to Hypoxia Tolerance of Tibetan Sheep and Their Application

【技术实现步骤摘要】
与藏绵羊耐低氧性能相关的遗传标记及其应用
本专利技术涉及动物分子育种学领域，特别涉及一种与藏绵羊耐低氧性能相关的遗传标记及其应用。
技术介绍
高原土著动物耐低氧适应的分子机制是生物学和医学的研究热点，对人类医学发展和高原动物种质资源保护利用具有重要意义。高原土著动物经过漫长的选择，形成了独特的低氧适应策略，心肺功能相对发达，血红蛋白含量、肺动脉压升高，血液缓冲能力增强；血红蛋白与氧结合和释放的能力显著提高；通过提高血红蛋白含量和低氧适应性变异从分子水平上进一步适应了高原低氧环境。藏绵羊分布在我国的青藏高原地区以及与之毗邻的川、甘、滇等高寒牧区，存栏量2500多万只，是青藏高原和中国羊业的主体，由于复杂的地域环境，使藏绵羊逐渐形成了独特的低氧适应策略来维持自身的氧平衡，且在形态、生理和分子上已获得稳定的高寒低氧适应性遗传特性。因此，探索藏绵羊低氧适应性进化的正选择基因序列及其遗传标记，有助于了解动物的保护利用、高原疾病和种质创新。血红素加氧酶(Hemoxygenase,HMOX)是血红素代谢中的关键限速酶，在机体低氧胁迫代谢调控过程中扮演着重要角色，藏绵羊在长期进化过程中形成了独特的低氧适应策略以维持自身的氧平衡。但是截止目前，关于血红素加氧酶家族基因(HMOX2)在藏绵羊耐低氧适应性中的研究却鲜有报道。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术实施例选择藏绵羊(低氧组)和湖羊(对照组)为研究对象，测定分析了藏绵羊和湖羊血液生理指标的差异，利用PCR-SSCP技术，对血红素加氧酶家族基因(HMOX2)进行分析，并对其基因进行变异位点的筛查，进一步分析变异位点对藏绵羊血液生理指标性状的影响。本专利技术提供了与藏绵羊耐低氧性能相关的遗传标记，其位于HMOX2基因上，存在等位基因A7、B7，当所述等位基因为A7、B7时，所述藏绵羊耐低氧性能良好；所述等位基因A7，在HMOX2基因第c.20911处的碱基为C，在第c.20990处的碱基为T；所述等位基因B7，在HMOX2基因的第c.20911处的碱基为T，第c.20990处处的碱基为C。本专利技术还提供了用于检测上述遗传标记的引物对，所述引物对为：上游引物：GGACCAGAGGCGTGAGA；下游引物：GGTGGGAGACACTGGAAAG。本专利技术还提供了用于检测藏绵羊耐低氧性能的试剂盒。本专利技术还提供了上述遗传标记在鉴定藏绵羊耐低氧性能中的应用，包括以下步骤：(1)提取待测藏绵羊的基因组DNA；(2)以待测藏绵羊的基因组DNA为模板，利用上述引物对进行PCR扩增；(3)鉴定PCR扩增产物，当所述等位基因为A7、B7时，所述藏绵羊耐低氧性能良好；所述等位基因A7，在HMOX2基因的第c.20911处的碱基为C，在第c.20990处的碱基为T；所述等位基因B7，在HMOX2基因的第c.20911处的碱基为T，第c.20990处的碱基为C。本专利技术还提供了上述遗传标记在藏绵羊分子标记辅助育种中的应用。所述PCR扩增时的扩增体系以20μL计为，Mix试剂10μL，ddH2O8.4μL，上、下游引物各0.4μL，DNA模板0.8μL。所述PCR扩增时的PCR反应条件为：95℃，5min；94℃，30s；Tm(退火温度)，30s；72℃，30s；35个循环；72℃，10min；4℃保存，使用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。所述鉴定PCR扩增产物是采用SSCP进行鉴定，包括将PCR产物2μL和变性缓冲液8μL混匀后在105℃变性10min，点样于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上，电泳结束后根据银染方法显色并判定电泳带型。附图说明图1是实施例1中绵羊HMOX2基因H5引物SSCP检测结果；图2是实施例1中绵羊HMOX2基因H6引物SSCP检测结果；图3是实施例1中绵羊HMOX2基因H7引物SSCP检测结果；图4是实施例1中绵羊HMOX2基因H8引物SSCP检测结果。具体实施例为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术的各实施例进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本专利技术各实施例中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施例的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。实施例1：1.材料与方法1.1试验样品选择健康，体况良好，年龄为3岁的成年藏绵羊(低氧组)340只和湖羊(对照组)343只(见表1)，采样时间为上午8:00-10:00，颈静脉采集血样10ml于含有抗凝剂的真空采血管中用于提取基因组DNA和测定血液指标。部分血液制成FTA(FlindersTechnologyAssociates)卡备用。表1绵羊的品种来源及样品数量1.2血液理化指标测定采样后在30分钟内完成血液指标测定，采用雅培I-stat300型(美国)血液分析仪测定血液中血血红蛋白含量(HGB)、红细胞压积(HCT)、氧分压(PO2)、氧饱和度(SpO2)、酸碱度(pH)、二氧化碳分压(PCO2)、碳酸氢根(HCO3-)、二氧化碳总量(TCO2)、血液酸碱度(BE)、钠离子(Na+)、钾离子(K+)及钙离子(Ca2+)等十二项指标。1.3基因组DNA的提取血液基因组DNA的提取参照北京全式金BloodGenomicDNAKit说明书。根据Zhou等(2006)描述两步法提取FTA保存的血液基因组DNA。1.4DNA混合池的构建从藏绵羊和湖羊样品中各选择无血缘关系30份基因组DNA，用紫外分光光度计测量每个DNA样品浓度各3次，取平均值，再将样品稀释到终浓度为100ng/μL，从同一品种30个DNA样品中各取5μL混合构建成2个品种DNA混合池。1.5HMOX2基因DNA混合池引物设计根据NCBI里提绵羊HMOX2基因序列(GenBankNo.NW_011942788)，针对HMOX2基因5'-UTR区域、6个外显子及3'-UTR区域设计5对引物(见表2)，引物由北京奥科鼎盛生物有限公司合成。表2绵羊HMOX2基因DNA混合池引物1.6HMOX2基因多态性引物设计根据HMOX2基因DNA混合池测序确定的变异位点，设计HMOX2基因PCR引物H5、H6、H7和H8(见表3)，分别扩增绵羊HMOX2基因第1外显子-第1内含子、第2外显子-第2内含子、第2内含子和第5外显子-第6外显子区域。表3绵羊HMOX2基因引物信息1.7HMOX2基因PCR体系PCR反应体系为20.0μL，Mix试剂(天根生化科技,北京)10μL，ddH2O8.4μL，上下游引物(5μmol/L)各0.4μL，基因组DNA(100ng/μL)0.8μL。PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，Tm(退火温度)，30s，72℃30s，35个循环；72℃10min，4℃保存。然后，使用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。1.8HMOX2基因SSCP电泳将PCR产物2.0μL和变性缓冲液8.0μL混匀后在105℃变性10min，点样于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上。电泳结束后根据Byun等银染方法显色并判定电泳带型，HMOX2基因的引物SSCP电泳最佳条件见表4。表4绵羊HMOX2基因PCR产物SSCP电泳1.9测序根据PCR产物的银染结果进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.与藏绵羊耐低氧性能相关的遗传标记，其特征在于，其位于HMOX2基因上，存在等位基因A7、B7，当所述等位基因为A7、B7时，所述藏绵羊高原低氧适应性良好；所述等位基因A7，在HMOX2基因第c.20911处的碱基为C，在第c.20990处的碱基为T；所述等位基因B7，在HMOX2基因的第c.20911处的碱基为T，第c.20990处处的碱基为C。

【技术特征摘要】
1.与藏绵羊耐低氧性能相关的遗传标记，其特征在于，其位于HMOX2基因上，存在等位基因A7、B7，当所述等位基因为A7、B7时，所述藏绵羊高原低氧适应性良好；所述等位基因A7，在HMOX2基因第c.20911处的碱基为C，在第c.20990处的碱基为T；所述等位基因B7，在HMOX2基因的第c.20911处的碱基为T，第c.20990处处的碱基为C。2.用于检测权利要求1所述遗传标记的引物对，其特征在于，所述引物对为：上游引物：GGACCAGAGGCGTGAGA；下游引物：GGTGGGAGACACTGGAAAG。3.用于检测藏绵羊耐低氧性能的试剂盒。4.权利要求1所述的遗传标记在鉴定藏绵羊耐低氧性能中的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测藏绵羊的基因组DNA；(2)以待测藏绵羊的基因组DNA为模板，利用权利要求2中所述的引物对进行PCR扩增；(3)鉴定PCR扩增产物，当所述等位基因为A7、B7时，所述藏绵羊耐低氧性能良好；所述等位基因A7，在HM...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘秀，何建文，胡江，王继卿，李少斌，罗玉柱，沙玉柱，张伟，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62