基于磁性分子印迹技术的靶向酶固定化载体的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种基于磁性分子印迹技术的靶向酶固定化载体的制备方法及应用：制备氨基四氧化三铁；制备硼酸修饰四氧化三铁；溶胶‑凝胶法制备分子印迹聚合物层；除去结合在分子印迹聚合物上的辣根过氧化物酶；封闭聚合物表面非特异性吸附残基，得到辣根过氧化物酶磁性分子印迹聚合物。本发明专利技术制备过程简单、成本低廉，得到的磁性分子印迹聚合物不仅能够特异性识别目标物质辣根过氧化物酶，而且可以对复杂样品中的辣根过氧化物酶直接通过吸附进行固定，形成的固定化酶可用于葡萄糖、肌氨酸、尿酸、胆固醇等能够分解产生H2O2的物质的检测。

Preparation and Application of Targeted Enzyme Immobilized Carrier Based on Magnetic Molecular Imprinting Technology

【技术实现步骤摘要】
基于磁性分子印迹技术的靶向酶固定化载体的制备方法及应用
本专利技术属于分析检测领域，具体涉及一种基于磁性分子印迹技术的靶向固定化辣根过氧化物酶及其载体的制备。
技术介绍
固定化酶技术是在保持酶催化活性的条件下，将酶限制或束缚在固相载体的一定区域内的一类技术。与非固定的游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,具有贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等优点。固定化酶已在化学、生物学、医学、食品科学以及环境科学等学科领域得到迅速发展和广泛的应用。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法制备固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。化学法包括结合法、交联法等。结合法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,交联法是使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。然而传统的固定化酶制备需要固定纯度较高的酶，而酶是一种稳定性较差的蛋白质，分离纯化过程复杂，分离成本较高，分离过程不可避免地会造成酶的损失和活性下降。因此，从复杂样品中实现目标酶的直接固定化具有十分重要的意义。分子印迹技术是一种合成对特定模板分子具有专一识别能力的聚合物的制备技术。其具有结构预定性、识别特异性、性质稳定性和广泛适用性的特点，能够在复杂样品中识别目标分子，已在分离分析、仿生催化、药物释放和生物传感器等领域得到广泛应用。因此，其具有从复杂样品直接制备固定化酶的潜能。目前小分子的印迹聚合物技术已趋于成熟，然而，对于水溶性蛋白质分子(例如，酶分子)，常用的在有机相中制备和识别的方法，如本体法、原位法和沉淀法等，由于蛋白质耐受有机溶剂和酸碱能力较差而并不适用，使得酶分子印迹聚合物的制备存在一定难度。目前未见分子印迹聚合物应用于固定化酶的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于磁性分子印迹技术的靶向酶固定化载体的制备方法及应用。为了实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种辣根过氧化物酶固定化载体的制备方法，包括以下步骤：1)制备氨基Fe3O4磁性纳米粒；2)利用氨基Fe3O4磁性纳米粒制备硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒；3)以辣根过氧化物酶为模板分子，将该模板分子固定在硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒上，然后在水相体系下，以3-氨丙基三乙氧基硅烷为功能单体、正硅酸乙酯为交联单体，采用溶胶-凝胶法制备得到包覆在硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒上的结合有所述模板分子的分子印迹聚合物层；4)去除所述分子印迹聚合物层中结合的模板分子(辣根过氧化物酶)，得到辣根过氧化物酶磁性分子印迹聚合物；5)封闭辣根过氧化物酶磁性分子印迹聚合物表面的非特异性吸附残基，得到辣根过氧化物酶固定化载体。优选的，所述氨基Fe3O4磁性纳米粒采用热溶剂法制备，具体包括以下步骤：将0.5-2.0gFeCl3·6H2O、1.0-4.0g无水乙酸钠和3-15g1,6-己二胺分散于20-60mL乙二醇中，得混合物，在20-40℃下搅拌至混合物变成透明溶液后转移到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，然后在160-200℃下反应6-12h，用磁铁收集反应产物，对所得产物进行洗涤、干燥。优选的，所述硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒是以4-甲酰基苯硼酸为硼酸试剂，利用其甲酰基与氨基Fe3O4磁性纳米粒表面的氨基反应生成亚胺，再以氰基硼氢化钠为还原剂，将亚胺还原为胺而得到的，具体包括以下步骤：将200-1000mg氨基Fe3O4磁性纳米粒及10-50mg4-甲酰基苯硼酸加入10-50mL无水甲醇中，然后在20-40℃下反应16-24h，用磁铁收集反应产物，对所得产物进行洗涤，得到不稳定的纳米粒修饰产物，将得到的纳米粒修饰产物及10-50mg氰基硼氢化钠加入10-50mL无水甲醇中，然后在20-40℃下继续反应18-24h，用磁铁收集反应产物，对所得产物(稳定结构的纳米粒修饰物)进行洗涤、干燥。优选的，所述模板分子的固定具体包括以下步骤：利用硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒对分散在溶剂中的辣根过氧化物酶进行吸附，其中，辣根过氧化物酶的分散浓度为125-1000μg·mL-1，所述溶剂为pH8.0-9.5的磷酸盐缓冲液，吸附温度为20-40℃，吸附时间为0.5-4h。优选的，所述水相体系由正硅酸乙酯、3-氨丙基三乙氧基硅烷、固定有模板分子的硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒以及体积分数0.005％-0.1％的吐温水溶液构成，其中，正硅酸乙酯与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为1:2-1:16，正硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷的总体积为5-20μL，所述吐温水溶液的体积为5-20mL，用于固定模板分子的硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒的质量为5-50mg。优选的，所述溶胶-凝胶法的反应条件为：在20-40℃下反应12-24h。优选的，所述步骤4)中，模板分子采用洗脱溶剂去除(洗脱时间16-32h)，洗脱溶剂为乙腈与醋酸水溶液的混合溶液，其中，乙腈:醋酸水溶液的体积比为2:8-4:6，醋酸水溶液的体积分数为2％-10％。优选的，所述步骤5)中，采用明胶、牛血清白蛋白或酪蛋白的溶液(例如，1-5mg·mL-1BSA溶液)封闭(20-40℃下15-60min)所述非特异性吸附残基(例如，辣根过氧化物酶非特异性吸附残基等)。一种固定化辣根过氧化物酶的制备方法，包括以下步骤：1)制备上述辣根过氧化物酶固定化载体；2)将上述辣根过氧化物酶固定化载体与含有辣根过氧化物酶的复杂样品(例如，辣根提取物)混合后，于20-40℃反应20-120min，然后利用磁性分离得到固定化辣根过氧化物酶。上述方法制备的辣根过氧化物酶固定化载体在制备固定化辣根过氧化物酶中的应用。上述固定化辣根过氧化物酶在葡萄糖、肌氨酸、尿酸、胆固醇等能够分解产生H2O2等物质的检测中的应用。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术分别以3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和正硅酸乙酯(TEOS)为功能单体和交联单体，采用非催化溶胶-凝胶技术，在水相中制备一种选择性高以及成本低廉的辣根过氧化物酶分子印迹聚合物，并将该分子印迹聚合物作为一种酶固定化载体实现复杂样品中辣根过氧化物酶的直接固定。本专利技术制备过程简单、成本低廉，得到的磁性分子印迹聚合物不仅能够特异性识别目标物质辣根过氧化物酶，而且可以对复杂样品中的辣根过氧化物酶直接通过吸附进行固定，形成的固定化酶可用于葡萄糖、肌氨酸、尿酸、胆固醇等能够分解产生H2O2的物质的检测。进一步的，本专利技术提出的非催化溶胶-凝胶法，在含有吐温的反应体系中，硅烷试剂可以乳化为均一的反应体系，加速水解聚合反应，得到均匀的聚合物，克服了传统溶胶-凝胶法需要在有机相中由酸或碱催化下水解聚合，可以在温和的反应条件下实现水溶性蛋白质(例如辣根过氧化物酶等酶分子)分子印迹聚合物的制备。附图说明图1为辣根过氧化物酶分子印迹聚合物表征结果：A为X射线粉末衍射图(a为Fe3O4-NH2，b为MIPs)；B为磁滞回线图(a为MIPs，b为Fe3O4-NH2)；C为硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒及MIPs的XPS表征图；D为硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒的XPS表征图的B特征本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种辣根过氧化物酶固定化载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)制备氨基Fe3O4磁性纳米粒；2)利用氨基Fe3O4磁性纳米粒制备硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒；3)以辣根过氧化物酶为模板分子，将该模板分子固定在硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒上，然后在水相体系下，以3‑氨丙基三乙氧基硅烷为功能单体、正硅酸乙酯为交联单体，采用溶胶‑凝胶法制备得到包覆在硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒上的结合有所述模板分子的分子印迹聚合物层；4)去除所述分子印迹聚合物层中结合的模板分子，得到辣根过氧化物酶磁性分子印迹聚合物；5)封闭辣根过氧化物酶磁性分子印迹聚合物表面的非特异性吸附残基，得到辣根过氧化物酶固定化载体。

【技术特征摘要】
1.一种辣根过氧化物酶固定化载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)制备氨基Fe3O4磁性纳米粒；2)利用氨基Fe3O4磁性纳米粒制备硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒；3)以辣根过氧化物酶为模板分子，将该模板分子固定在硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒上，然后在水相体系下，以3-氨丙基三乙氧基硅烷为功能单体、正硅酸乙酯为交联单体，采用溶胶-凝胶法制备得到包覆在硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒上的结合有所述模板分子的分子印迹聚合物层；4)去除所述分子印迹聚合物层中结合的模板分子，得到辣根过氧化物酶磁性分子印迹聚合物；5)封闭辣根过氧化物酶磁性分子印迹聚合物表面的非特异性吸附残基，得到辣根过氧化物酶固定化载体。2.根据权利要求1所述一种辣根过氧化物酶固定化载体的制备方法，其特征在于：所述氨基Fe3O4磁性纳米粒采用热溶剂法制备。3.根据权利要求1所述一种辣根过氧化物酶固定化载体的制备方法，其特征在于：所述硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒的制备是以4-甲酰基苯硼酸为硼酸试剂。4.根据权利要求1所述一种辣根过氧化物酶固定化载体的制备方法，其特征在于：所述模板分子的固定具体包括以下步骤：利用硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒对分散在溶剂中的辣根过氧化物酶进行吸附，其中，辣根过氧化物酶的分散浓度为125-1000μg·mL-1，所述溶剂为pH8.0-9.5的磷酸盐缓冲液，吸附温度为20-40℃，时间为0.5-4h。5.根据权利要求1所述一种辣根过氧化物酶固定化载体的制备方法，其特征在于：所述水相体系由正硅酸乙酯、3-氨丙基三乙氧基硅烷、固定有模板分子的硼酸修饰Fe3O4磁性纳米粒以及体积分数0.005％-0.1％的吐温水溶液构成，其中，正硅酸乙酯与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为1:2-1:16，正硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅强，陈国宁，舒花，王璐，王燕，常春，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61