二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体、和利用了该变异体的烯烃化合物的制造方法技术

本发明专利技术的目的是提供能以高生产率制造烯烃化合物的方法、和用于该方法的酶，对二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)的各部位导入伴随氨基酸替换的变异，制备了多种MVD的变异体。然后，对于变异体评价对于异戊二烯等烯烃化合物的生成的催化活性，结果发现，通过将153位的丝氨酸和209位的苏氨酸各自替换成其他氨基酸，上述催化活性提高。另外表明，通过进一步将152位的甘氨酸替换成其他氨基酸，所述变异体的催化活性进一步提高。

Methylovalerate diphosphate decarboxylase variant and method for manufacturing olefins using the variant

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体、和利用了该变异体的烯烃化合物的制造方法
本专利技术涉及利用了二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的烯烃化合物的制造方法。另外本专利技术涉及上述变异体及其制造方法，进一步还涉及编码上述变异体的DNA、和插入了该DNA的载体。另外本专利技术涉及利用导入了上述DNA或上述载体的宿主细胞的烯烃化合物的制造方法，进一步还涉及包含上述变异体、上述DNA或上述载体的用于促进烯烃化合物的生成的制剂。
技术介绍
异戊二烯等烯烃化合物作为合成橡胶等各种合成聚合物的原料极为有用，这些化合物可以通过石油分馏这样的化学方法得到。然而，即使在这样的化学方法中，其收率也低，花费制造成本，另外需要时间。进而考虑近来的环境问题，要求开发不浪费有限资源的、对环境温和的可持续的烯烃化合物的制造方法以代替化学方法。鉴于这种状况，尝试了利用或改变微生物等的代谢途径来制造烯烃化合物。例如，开发了对参与甲羟戊酸途径的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶等导入变异，利用该变异酶的异戊二烯等的制造方法(专利文献1～3)。另外，本专利技术者们也尝试了在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中导入1个或多个氨基酸变异，将该酶(二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体)的底物特异性从原来的针对5-二磷酸甲羟戊酸变更为针对3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸等，从而制造异戊二烯等。更具体地，在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的各部位导入伴随氨基酸替换的变异，制备了约200个二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的变异体。然后，本专利技术者们对于这些变异体，评价了关于异戊二烯的生成的催化活性。其结果本专利技术者们搞清楚了，74位的精氨酸被替换成组氨酸、且209位的苏氨酸被替换成精氨酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(R74HT209R)在约200个变异体的中出类拔萃地对于异戊二烯的生成显示极高的催化活性(非专利文献1)。现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开第2013/092567号专利文献2：国际公开第2015/004211号专利文献3：国际公开第2015/021045号非专利文献非专利文献1：折下凉子等，“有用酵素の基質特異性改変とバイオイソプレン生産への応用(有用酶的底物特异性改变和在生物异戊二烯生产中的应用)”、日本农艺化学会大会讲演要旨集、vol.2016、p.2J003(2016年3月5日发行)、及其随附海报(2016年3月28日公开)
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术是鉴于上述课题而做出的，目的是提供能以高生产率制造烯烃化合物的酶。用于解决课题的方法本专利技术者们们为了在上述的R74HT209R之外，进一步获得在异戊二烯的生成中显示高催化活性的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的变异体，反复进行了深入研究。其结果搞清楚了，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的153位的丝氨酸和209位的苏氨酸各自被替换成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(S153XT209X)具有生成异戊二烯的高催化活性。特别是搞清楚了，与作为在约200个变异体中对于异戊二烯的生成具有极高催化活性的变异体之前唯一得到的R74HT209R相比，S153XT209X具有进一步高达约4倍以上的催化活性。此外，本申请说明书的记载中，上述那样的“X”是指在各部位被替换成的其他氨基酸(例如，“S153X”的“X”是指丝氨酸以外的氨基酸，T209X的“X”是指苏氨酸以外的氨基酸)。进而，本专利技术者们在前述的S153XT209X中进一步将152位的甘氨酸也替换成其他氨基酸。其结果发现，所述催化活性进一步提高1.3倍。进一步另外表明，在该三重变异体(G152XS153XT209X)中，通过进一步将74位的精氨酸替换成其他氨基酸，从而所述催化活性进一步提高最大超过3倍。另外，确认了这些二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的变异体不仅在异戊二烯的生成中，而且在异丁烯的生成中也显示高催化活性，从而完成了本专利技术。即，本专利技术提供以下＜1＞～＜24＞。＜1＞烯烃化合物的制造方法，包括：在序列号2所记载的氨基酸序列的153位的丝氨酸或与该部位对应的丝氨酸、和209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸各自变异成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶存在下，使下述式(1)所示的化合物与ATP反应的工序，式(1)中，R1和R2各自独立地表示氢原子、碳数1～10的烷基、碳数2～15的烯基、碳数6～20的芳基或卤素原子，所述烷基和烯基各自独立地可以被羟基和/或羧基任意取代。＜2＞烯烃化合物的制造方法，包括：将导入了以下DNA或包含该DNA的载体的宿主细胞进行培养，采集该宿主细胞和/或其培养物中生成的烯烃化合物的工序，所述DNA编码序列号2所记载的氨基酸序列的153位的丝氨酸或与该部位对应的丝氨酸、和209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸各自变异成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的制造方法，在所述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，序列号2所记载的氨基酸序列的153位的丝氨酸或与该部位对应的丝氨酸所变异成的其他氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。＜4＞根据＜1＞～＜3＞中的任一项所述的制造方法，在所述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸所变异成的其他氨基酸是天冬氨酸。＜5＞根据＜1＞～＜4＞中的任一项所述的制造方法，所述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶是进一步序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸变异成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。＜6＞根据＜5＞所述的制造方法，在所述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸所变异成的其他氨基酸是亮氨酸。＜7＞根据＜5＞或＜6＞所述的制造方法，所述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶是进一步序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸变异成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。＜8＞根据＜7＞所述的制造方法，在所述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸所变异成的其他氨基酸是酪氨酸、组氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺。＜9＞根据权利要求＜1＞～＜8＞中的任一项所述的制造方法，所述烯烃化合物是异戊二烯。＜10＞根据权利要求＜1＞～＜8＞中的任一项所述的制造方法，所述烯烃化合物是异丁烯。＜11＞生成烯烃化合物的催化活性提高了的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的制造方法，该制造方法包括：在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，使序列号2所记载的氨基酸序列的153位的丝氨酸或与该部位对应的丝氨酸、和209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸各自变异成其他氨基酸的工序。＜12＞根据＜11＞所述的制造方法，在所述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，序列号2所记载的氨基酸序列的153位的丝氨酸或与该部位对应的丝氨酸所变异成的其他氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。＜13＞根据＜11＞或＜12＞所述的制造方法，在所述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸所变异成的其他氨基酸是天冬氨酸。＜14＞根据＜11＞～＜13＞中的任一项所述的制造方法，进一步包括：在所述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，使序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸变异成其他氨基酸的工序。＜15＞根据＜14＞所述的制造方法，在所述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.烯烃化合物的制造方法，包括：在序列号2所记载的氨基酸序列的153位的丝氨酸或与该部位对应的丝氨酸、和209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸各自变异成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶存在下，使下述式(1)所示的化合物与ATP反应的工序，

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.02.01 JP 2017-0168641.烯烃化合物的制造方法，包括：在序列号2所记载的氨基酸序列的153位的丝氨酸或与该部位对应的丝氨酸、和209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸各自变异成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶存在下，使下述式(1)所示的化合物与ATP反应的工序，式(1)中，R1和R2各自独立地表示氢原子、碳数1～10的烷基、碳数2～15的烯基、碳数6～20的芳基或卤素原子，所述烷基和烯基各自独立地可以被羟基和/或羧基任意取代。2.烯烃化合物的制造方法，包括：将导入了以下DNA或包含该DNA的载体的宿主细胞进行培养，采集该宿主细胞和/或其培养物中生成的烯烃化合物的工序，所述DNA编码序列号2所记载的氨基酸序列的153位的丝氨酸或与该部位对应的丝氨酸、和209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸各自变异成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。3.根据权利要求1或2所述的制造方法，在所述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，序列号2所记载的氨基酸序列的153位的丝氨酸或与该部位对应的丝氨酸所变异成的其他氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。4.根据权利要求1～3中的任一项所述的制造方法，在所述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸所变异成的其他氨基酸是天冬氨酸。5.根据权利要求1～4中的任一项所述的制造方法，所述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶是进一步序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸变异成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。6.根据权利要求5所述的制造方法，在所述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸所变异成的其他氨基酸是亮氨酸。7.根据权利要求1～6中的任一项所述的制造方法，所述烯烃化合物是异戊二烯。8.生成烯烃化合物的催化活性提高了的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的制造方法，该制造方法包括：在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，使序列号2所记载的氨基酸序列的153位的丝氨酸或与该部位对应的丝氨酸、和209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸各自变异成其他氨基酸的工序。9.根据权利要求8所述的制造方法，在所述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，序列号2所记载的氨基酸序列的153位的丝氨酸或与该部位对应的丝氨酸所变异成的其他氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。10.根据权利要求8或9所述的制造方法，在所述二磷酸甲...

【专利技术属性】
技术研发人员：折下凉子，白井智量，高桥和弘，日座操，田边祐介，
申请(专利权)人：国立研究开发法人理化学研究所，日本瑞翁株式会社，横滨橡胶株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP