基因组编辑方法技术

经基因组编辑的细胞或非人生物的制造方法，包括将(a)基因组编辑对象区域的两端的人工核酸酶系统、和(b)单链DNA导入细胞或非人生物的工序，所述(b)单链DNA包含从5′侧开始以5′侧同源臂序列、供体DNA序列、3′侧同源臂序列的顺序配置的碱基序列，所述5′侧同源臂序列是所述基因组编辑对象区域外侧的一边的碱基序列的同源序列，且所述3′侧同源臂序列是所述基因组编辑对象区域外侧的另一边的碱基序列的同源序列。

Genome editing methods

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因组编辑方法
本专利技术涉及基因组编辑方法等。
技术介绍
基因改变小鼠被全世界的研究者用于在个体水平上分析基因功能。特别是条件性敲除小鼠能够细胞组织特异地和时期特异地控制基因表达，因此是最被广泛利用的基因改变小鼠之一。条件性敲除小鼠通过整合有Cre表达盒的“Cre小鼠”和以loxP序列夹着靶标基因或其一部分的“flox小鼠”交配而制作。该Cre小鼠、flox小鼠的制作中，将到目前为止主要利用小鼠ES细胞，或通过将其一部分、Cre表达盒对ES细胞同源重组而敲入后，将所得的细胞注入小鼠胚泡中，将该胚移植到假孕雌小鼠中，经由嵌合小鼠制作Cre小鼠、flox小鼠。但是，利用ES细胞的同源重组需要熟练的知识和技术，因此仅重组ES细胞的建立就需要数月。另外由于经由嵌合小鼠，所以最终制作条件性小鼠需要1～2年。近年来，随着新的基因组编辑技术CRISPR/Cas系统的出现，能够不利用ES细胞地用受精卵更简便地进行基因改变。通过受精卵中注入CasmRNA和指导RNA，指导RNA与靶标部位结合，在该结合部位被诱导的Cas蛋白质将DNA进行双链切断，结果能够在作为靶标的基因中导入突变。这时，通过将单链寡核苷酸(ssODN)一起注入，还可以有效地敲入1～数十碱基长的DNA序列(非专利文献1)。另一方面，在通过CRISPR/Cas系统制作flox小鼠时，如果能够在2处同时敲入loxP序列则是有效的，但实际上仅在1处敲入loxP序列的情况频发。此时，需要使仅在1处敲入了loxP序列的小鼠增产，对从该敲入小鼠采集的受精卵导入CRISPR/Cas系统，在另1处敲入loxP序列，又要花费近1年。利用现有的供体载体同时在2处插入loxP序列在理论上也是可能的，但实际上得到flox小鼠的效率不高。现有技术文献非专利文献非专利文献1：SanderJD,JoungJK.‘CRISPR-Cassystemsforediting,regulatingandtargetinggenomes.’,NatBiotechnol.2014Apr；32(4):347-55.
技术实现思路
专利技术要解决的课题本专利技术的课题是提供对于比较长的区域的突变或比较长的区域内的多处突变(例如，2处loxP序列的插入)也能够更简便且有效地导入的新的基因组编辑方法。用于解决课题的手段本专利技术者鉴于上述课题进行了深入研究，结果发现，通过使用(a)基因组编辑对象区域的两端的人工核酸酶系统、和(b)单链DNA这2者，能够简便且有效地进行基因组编辑，所述(b)单链DNA包含从5′侧开始以5′侧同源臂序列、供体DNA序列、3′侧同源臂序列的顺序配置的碱基序列，所述5′侧同源臂序列是所述基因组编辑对象区域外侧的一边的碱基序列的同源序列，且所述3′侧同源臂序列是所述基因组编辑对象区域外侧的另一边的碱基序列的同源序列。特别是通过作为人工核酸酶系统使用CRISPR/Cas系统，作为单链DNA使用供体DNA序列包含2处重组酶识别序列的单链DNA，将它们通过电穿孔法导入对象，能够高效率地获得在2个等位基因的基因组编辑对象区域的两端添加了重组酶识别序列的个体。另外，通过作为人工核酸酶系统的导入对象利用包含重组酶表达盒的受精卵，能够大幅缩短目的个体的制作时间。进而，本专利技术者发现，通过作为单链DNA中的5′侧同源臂采用比较长链的序列，能够提高上述效率，从而完成了本专利技术。即，本专利技术包含下述方式：[1]一种经基因组编辑的细胞或非人生物的制造方法，包括将(a)切断基因组编辑对象区域的两端的人工核酸酶系统、和(b)单链DNA导入细胞或非人生物的工序，所述(b)单链DNA包含从5′侧开始以5′侧同源臂序列、供体DNA序列、3′侧同源臂序列的顺序配置的碱基序列，所述5′侧同源臂序列是所述基因组编辑对象区域外侧的一边的碱基序列的同源序列，且所述3′侧同源臂序列是所述基因组编辑对象区域外侧的另一边的碱基序列的同源序列。[2]根据[1]所述的方法，所述人工核酸酶系统是CRISPR/Cas系统。[3]根据[1]或[2]所述的方法，将所述人工核酸酶系统和所述单链DNA通过电穿孔法导入所述细胞或非人生物。[4]根据[3]所述的方法，所述供体DNA序列包含2处重组酶识别序列，所述人工核酸酶系统和所述单链DNA的导入对象是包含重组酶表达盒的受精卵。[5]根据[1]～[4]的任一项所述的方法，所述5′侧同源臂序列的长度为110碱基长以上。[6]根据[1]～[4]的任一项所述的方法，所述5′侧同源臂序列的长度为130碱基长以上。[7]根据[1]～[4]的任一项所述的方法，所述5′侧同源臂序列的长度为260碱基长以上。[8]一种基因组编辑用组合物，包含(a)切断基因组编辑对象区域的两端的人工核酸酶系统、和(b)单链DNA，其包含从5′侧开始以5′侧同源臂序列、供体DNA序列、3′侧同源臂序列的顺序配置的碱基序列，所述5′侧同源臂序列是所述基因组编辑对象区域外侧的一边的碱基序列的同源序列，且所述3′侧同源臂序列是所述基因组编辑对象区域外侧的另一边的碱基序列的同源序列。[9]一种基因组编辑用试剂盒，包含(a)切断基因组编辑对象区域的两端的人工核酸酶系统、和(b)单链DNA，其包含从5′侧开始以5′侧同源臂序列、供体DNA序列、3′侧同源臂序列的顺序配置的碱基序列，所述5′侧同源臂序列是所述基因组编辑对象区域外侧的一边的碱基序列的同源序列，且所述3′侧同源臂序列是所述基因组编辑对象区域外侧的另一边的碱基序列的同源序列。专利技术的效果根据本专利技术，能够有效地将基因组编辑对象区域更简便且有效地替换成任意的供体DNA序列。由此，即使是通过使用比较短的单链寡核苷酸(ssODN)的现有方法(非专利文献1等)困难的、比较长的区域的突变或比较长的区域内的多处突变(例如，2处loxP序列的插入)，也能够更简便且有效地导入。另外，在使用ES细胞的方法、使用比较短的单链寡核苷酸(ssODN)的方法(非专利文献1等)等现有方法中，制作条件性敲除小鼠最低要1年，但如果使用本专利技术的基因组编辑方法，则能够用更短时间(例如，3～6个月、如果使用Cre小鼠受精卵则进一步短时间)制作条件性敲除小鼠。与此相伴，还能够大幅降低条件性敲除小鼠的制作费用(作为一试算例，现有方法：300～900万日元/系统→本专利技术的方法：50～100万日元/系统)。进而，在本专利技术的方法中，可以将对基因组编辑对象细胞的各种工具(上述材料(a)和(b))的导入通过电穿孔法来进行。目前通常采用显微注射法，结果通过采用该电穿孔法，能够更简便且有效地进行基因组编辑。现在，进行了对于约3万基因的全面的敲除小鼠制作计划，结果通过本专利技术，能够使这样的计划的进行加速。附图说明图1显示基因组编辑试验1(实施例1)的方案。mSerpina3n表示基因组编辑前的基因组DNA，lssDNA表示单链DNA，floxed-mSerpina3n表示基因组编辑后的基因组DNA。剪刀图形表示被CRISPR/Cas系统切断的部位(2个剪刀图形所夹的区域是基因组编辑对象区域)、gRNA-1和gRNA-2表示以切断基因组编辑对象区域的两端的方式设计的2段指导RNA，箭头(F1和R1)表示在基因型分型中使用的PCR引物的位置，该箭头的朝向表示该引本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种经基因组编辑的细胞或非人生物的制造方法，包括将(a)切断基因组编辑对象区域的两端的人工核酸酶系统、和(b)单链DNA导入细胞或非人生物的工序，所述(b)单链DNA包含从5′侧开始以5′侧同源臂序列、供体DNA序列、3′侧同源臂序列的顺序配置的碱基序列，所述5′侧同源臂序列是所述基因组编辑对象区域外侧的一边的碱基序列的同源序列，且所述3′侧同源臂序列是所述基因组编辑对象区域外侧的另一边的碱基序列的同源序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.28 JP 2016-2299761.一种经基因组编辑的细胞或非人生物的制造方法，包括将(a)切断基因组编辑对象区域的两端的人工核酸酶系统、和(b)单链DNA导入细胞或非人生物的工序，所述(b)单链DNA包含从5′侧开始以5′侧同源臂序列、供体DNA序列、3′侧同源臂序列的顺序配置的碱基序列，所述5′侧同源臂序列是所述基因组编辑对象区域外侧的一边的碱基序列的同源序列，且所述3′侧同源臂序列是所述基因组编辑对象区域外侧的另一边的碱基序列的同源序列。2.根据权利要求1所述的方法，所述人工核酸酶系统是CRISPR/Cas系统。3.根据权利要求1或2所述的方法，将所述人工核酸酶系统和所述单链DNA通过电穿孔法导入所述细胞或非人生物。4.根据权利要求3所述的方法，所述供体DNA序列包含2处重组酶识别序列，所述人工核酸酶系统和所述单链DNA的导入对象是包含重组酶表达盒的受精卵。5.根据权利要求1～4的任一项所述的方法，所述5′侧同源臂序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：真下知士，宫坂佳树，
申请(专利权)人：国立大学法人大阪大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP