一种分泌抗蓝舌病病毒NS3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞制造技术

本申请属于生物技术领域，涉及但不限于一种分泌抗蓝舌病病毒NS3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。本申请利用蓝舌病血清1型病毒作为免疫原，得到能够分泌对蓝舌病病毒具有群特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及由其分泌的单克隆抗体。本申请产生的单克隆抗体能够取代兔源蓝舌病病毒抗体与蓝舌病病毒NS3蛋白结合。

A Hybridoma Cell Secreting Monoclonal Antibody Against Bluetongue Virus NS3 Protein

【技术实现步骤摘要】
一种分泌抗蓝舌病病毒NS3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞
本申请属于生物
，具体地涉及一种分泌抗蓝舌病病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞及由其分泌的单克隆抗体。
技术介绍
蓝舌病是由蓝舌病病毒感染引起的、由昆虫(主要是库蠓)传播的反刍动物病毒性传染病。蓝舌病病毒属于呼肠孤病毒科，环状病毒属蓝舌病病毒亚群。蓝舌病最早于1876年在南非被发现，因其感染动物后，动物的口腔粘膜及舌头会变蓝，故而在1906年被命名为“蓝舌病”。在1940年以前，蓝舌病仅仅在非洲传播。然而，在1948年，美国也报道了此病。我国于1979年在云南省师宗县首次发现蓝舌病，并分离得到蓝舌病病毒。抗蓝舌病病毒的单克隆抗体是蓝舌病诊断中非常好用的工具。然而，蓝舌病病毒有24个血清型(最近几年国外又陆续发现3个新的血清型，但对这3个新血清型的具体研究才刚刚起步)，而常用的单克隆抗体只对一种或至多几种蓝舌病病毒血清型敏感，因此很难满足蓝舌病的群特异性诊断方面的研究需要。已经报道的具有群特异性的蓝舌病病毒单克隆抗体并不是通过用天然病毒免疫获得的，而是通过用人工表达的蛋白免疫后制备的。这种单克隆抗体和通过用天然病毒免疫制备获得的单克隆抗体是不能完全等同的。因此，本领域需要对蓝舌病病毒具有群特异性、通过用天然病毒免疫制备获得的单克隆抗体。
技术实现思路
本申请的一个目的是得到能够分泌对蓝舌病病毒具有群特异性且对其NS3蛋白敏感的单克隆抗体的杂交瘤细胞。蓝舌病病毒(BTV)的NS3蛋白由蓝舌病病毒的S10基因编码，并且是高度保守的。NS3蛋白包括NS3蛋白和NS3A蛋白，同一血清型的这两种蛋白的氨基酸排列顺序相同，只是后者少了13个氨基酸。如果能够获得对NS3蛋白敏感的单克隆抗体，那么该单克隆抗体在绝大多数情况下对这两个蛋白都敏感，并且很可能具有群特异性。本申请提供了能够分泌抗蓝舌病病毒NS3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，以及由该杂交瘤细胞分泌的抗蓝舌病病毒NS3蛋白单克隆抗体。特别地，本申请在第一方面提供了一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体对蓝舌病病毒具有群特异性。在本申请中，所述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体对蓝舌病1-24血清型病毒具有群特异性。在本申请中，所述杂交瘤细胞通过利用蓝舌病血清1型病毒作为免疫原制备获得。在本申请中，所述杂交瘤细胞的保藏编号为CCTCC：C2014202。本申请在第二方面提供了一种单克隆抗体，其包含由本申请的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。本申请在第三方面提供了由本申请的杂交瘤细胞分泌的抗蓝舌病病毒NS3蛋白单克隆抗体。在本申请中，所述单克隆抗体能够取代兔源蓝舌病病毒抗体与蓝舌病病毒NS3蛋白结合。本申请在第四方面提供了本申请的单克隆抗体在制备用于蓝舌病诊断的试剂盒中的用途。与现有技术相比，由本申请的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体来源于用天然蓝舌病病毒颗粒的免疫并且对蓝舌病病毒具有优异的群特异性。由于没有证据显示人工表达的病毒蛋白的构象与天然病毒蛋白的构象完全相同，因此，用人工表达的病毒蛋白免疫产生的抗体与用天然病毒蛋白免疫产生的抗体当然也不会相同。由于本申请的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体是利用蓝舌病天然病毒颗粒获得的，所以其与蓝舌病病毒的结合更接近天然状态。本申请的其它特征和优点将在随后的描述中阐述，并且，部分地从这些描述中变得明显，或者通过实施本申请而被了解。本申请的其它目的和特点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现与获得。附图说明附图仅用来提供对本申请技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，而不构成对本申请技术方案的限制。图1为由本申请的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体对蓝舌病1-24血清型病毒的特异性测定结果。其中，“阴对”指阴性对照，即使用不含蓝舌病病毒抗体的血清。“阳对”指阳性对照，即使用含有蓝舌病病毒多克隆抗体的血清。其中编号1-24分别代表蓝舌病1-24血清型病毒。图2为由本申请的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体对外围的阿卡斑病毒(AKAV)、牛流行热病毒(BEFV)、中山病毒(CHUV)的特异性检测结果。其中“AKAV”代表对阿卡斑病毒的检测项；“BEFV”代表对牛流行热病毒的检测项；“CHUV”代表对中山病毒的检测项；“AKAV+”代表阿卡斑病毒抗体的阳性对照；“BEFV+”代表牛流行热病毒抗体的的阳性对照；“CHUV+”代表中山病毒抗体的阳性对照；“阴对”代表阴性对照，即使用对应的分别不含针对AKAV、BEFV或CHUV的抗体的阴性血清。图3为对本申请的抗蓝舌病病毒单克隆抗体进行WesternBlot的检测结果。其中“BTV”是指蓝舌病病毒；“细胞”是指BHK细胞对照；“M”是指蛋白分子量标志物。具体实施方式为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下文将结合附图和实施例对本申请进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请实施例中的特征可以相互任意组合。本申请采用高度纯化的蓝舌病血清1型病毒对4-6周龄的BALB/c雌性小鼠进行3次免疫，提取被免疫的小鼠的脾内B淋巴细胞，将其与用8氮杂鸟嘌呤处理过的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，并用HAT选择性培养基进行分板培养。当杂交瘤细胞克隆形成后，通过ELISA方法对蓝舌病病毒抗体进行检测。定期更换培养基并检测每个克隆的抗体滴度，挑选能够稳定分泌抗体的每一个杂交瘤细胞克隆，并分别进行再克隆，同时用ELISA方法继续监测抗体分泌情况。最后将所有能够持续分泌蓝舌病抗体的杂交瘤细胞都分别进行扩大培养，然后冻存并一一对应地收集由它们所分泌的单克隆抗体。对每一种单克隆抗体进行针对蓝舌病1-24血清型病毒的特异性检测。将对蓝舌病1-24血清型病毒都具备结合特异性的单克隆抗体所对应的杂交瘤细胞株进行单独标记，并对这些单克隆抗体进行外围其它相关病毒的特异性检测。当所得到的单克隆抗体对24种蓝舌病血清型都敏感而对外围病毒都不敏感时，进行WesternBlot检测。若检测到有25KD-26KD的条带，说明该单克隆抗体对蓝舌病病毒NS3蛋白敏感，该单克隆抗体是期望的单克隆抗体，产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞则是期望的杂交瘤细胞。本申请提供的期望的杂交瘤细胞已经保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，细胞名：HYBASVIGL-1；保藏编号：C2014202；保藏日期：2015年1月18日。实施例制备分泌抗蓝舌病病毒NS3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞以下试剂和材料如无特殊说明，均为普通市售商品。一、实验材料1、试剂：纯化的蓝舌病血清1型病毒云南毒株，本单位实验室分离得到并保存；1×RPMI1640培养液(货号：SH30809.01B)，HyClone产品；胎牛血清(货号：10099-141)，GIBCO产品；8-氮杂鸟嘌呤(货号：1001510707)、HAT(H-hypoxanthine(次黄嘌呤)、A-aminopterin(氨基蝶呤)、T-thymidine(胸腺嘧啶脱氧核苷)，货号：1002424466)、HT(H-hypoxanthin(次黄嘌呤)、T-thymidine(胸腺嘧啶脱氧核苷)，货号：1001506328)、50％PEG(货号：P7181)，均为SIGMA产本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体对蓝舌病病毒具有群特异性。

【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体对蓝舌病病毒具有群特异性。2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞，其中，所述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体对蓝舌病1-24血清型病毒具有群特异性。3.根据权利要求1或2所述的杂交瘤细胞，其中，所述杂交瘤细胞通过利用蓝舌病血清1型病毒作为免疫原制备获得。4.根据权利要求1-3中任一项所述的杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞的保藏编号为CCTCC：C20...

【专利技术属性】
技术研发人员：高林，李乐，李华春，何于雯，朱建波，苗海生，肖雷，杨恒，谢佳芮，廖德芳，李楠，孟锦昕，
申请(专利权)人：云南省畜牧兽医科学院，
类型：发明
国别省市：云南,53