植物生产口服EPO与转铁蛋白融合蛋白胶囊的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及植物生产口服EPO与转铁蛋白融合蛋白胶囊的应用。本发明专利技术利用植物例如生菜作为重组蛋白质生产的有效表达平台，利用简单以及高效的表达体系生产生物活性物质。随后将生产该活性物质的叶片冻干经特殊生产工艺制成胶囊。此胶囊可以在常温保存而保持生物活性。利用Western Blot蛋白杂交法确定贫血性治疗活性蛋白成功表达。生物活性测试结果表明利用该平台技术生产的贫血性治疗胶囊显著提升了小鼠的红细胞数量。

Application of Plant Production of Oral EPO and Transferrin Fusion Protein Capsules

【技术实现步骤摘要】
植物生产口服EPO与转铁蛋白融合蛋白胶囊的应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及植物生产口服EPO与转铁蛋白融合蛋白胶囊的应用。
技术介绍
促红细胞生成素(EPO)又称红细胞刺激因子，为糖蛋白，分子量约在2.5万～4.5万之间，是刺激红细胞生成的重要因素。动物在体缺氧的刺激下，肾脏产生的红细胞生成酶(Erythrogenin)作用于血浆内由肝生成的促红细胞生成素原，使它转化为促红细胞生成素。促红细胞生成素作用于骨髓内原始血细胞，使之转化为原始红细胞(Proerythroblast)；促进有核红细胞的有丝分裂和血红蛋白的合成；促进骨髓内成网织红细胞和成熟红细胞的释放。大量成熟红细胞携带更多的氧到组织，氧充足作为一种负反馈信息又可抑制肝脏生成红细胞生成素和肾脏产生红细胞生成酶，这样调节红细胞的生成量。EPO属唾液糖蛋白激素，是最早于1906年被发现的，是一种人体内源性化合物，分子量为34000，由165个氨基酸组成。它主要来源于肾脏(少量来源于肝脏)，由皮质管周围的间质细胞合成。由基因重组技术合成的rhEPO分子量为30400，其理化性质和生物学活性与天然内源性红细胞生成素相同，其不同点是基因位点在7号染色体为糖蛋白。EPO的生理作用是通过与幼红细胞形集落形成单位(CFu-E)或其早幼阶段的红细胞系爆裂形成单位(BFuE)的受体结合，并促进其向红细胞前体(网织红细胞)和原红细胞分化，最后生成红细胞(RBC)。当人的肾功能发生严重损害时，如在急慢性肾衰竭或肾切除的情况下，EPO的产生减少，出现贫血。因此EPO对绝大多数肾性贫血患者均有很好的疗效，由于EPO在临床有着肯定疗效，其产品已被列入了我国《国家基本医疗保险目录》。尽管天然EPO在治疗贫血性疾病上有诸多优点，目前已经上市的相关产品有促红细胞生长素等。由于多肽类药物本身的性质以及人体对其产生的各种屏障，其常规给药途经一直以注射为主。EPO通过特殊的制剂方式也实现了口服给药，而本专利技术将EPO与转铁蛋白融合表达，同样实现在口服给药，减轻病患长期频繁注射带来的痛苦。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种植物生产口服EPO与转铁蛋白融合蛋白胶囊的应用。本专利技术对具有贫血性治疗作用的促红细胞生成素(EOP)进行结构改造和修饰，使其获得可通过肠道进行吸收并在体内达到有效治疗浓度的特性，并通过植物来生产该活性物质。本专利技术利用植物尤其是生菜作为重组蛋白生产的高效平台技术，表达了EPO与转铁蛋白的融合蛋白。并且制成口服贫血性治疗胶囊。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了EPO与转铁蛋白的融合蛋白，其具有：(Ⅰ)、如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；或(Ⅱ)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或(III)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述序列至少有80％同源性的氨基酸序列。本专利技术还提供了编码所述融合蛋白的核苷酸，具有(Ⅰ)、如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；或(Ⅱ)、如SEQID2所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或(IV)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(V)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)或(IV)所述核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了表达载体，包括所述的核苷酸以及待转化载体。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述待转化载体为叶绿体表达载体。此外，本专利技术还提供了所述的表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：分别将所述EPO与转铁蛋白的融合蛋白的密码子优化为植物偏好的密码子，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；步骤2：将所述核苷酸序列克隆到pUC57载体中，获得pEPO。本专利技术还提供了所述的表达载体或植物在表达EPO与转铁蛋白的融合蛋白或制备包含所述融合蛋白的药物中的应用；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述药物为治疗贫血的口服制剂。本专利技术还提供了宿主，转化有所述表达载体的植物或微生物；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。本专利技术还提供了药物，包括所述的融合蛋白以及药学上可接受的辅料。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述药物为治疗贫血的口服制剂。本专利技术还提供了一种植物作为宿主表达EPO与转铁蛋白的融合蛋白的方法，将所述的表达载体用基因枪轰击叶片，在植物叶绿体中表达后获得再生植株，将植物叶片冻干粉碎、提取，获得EPO与转铁蛋白的融合蛋白。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述基因枪轰击包括如下步骤：步骤1：准备转化用载体；步骤2：准备微粒子弹；步骤3：基因枪轰击；步骤4：转换后培养、再生为植株。本专利技术还提供了一种植物作为宿主制备治疗贫血的药物的方法，将所述的表达载体用基因枪轰击叶片，在植物叶绿体中表达后获得再生植株，将植物叶片冻干粉碎、提取，获得EPO与转铁蛋白的融合蛋白，灌装。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述基因枪轰击包括如下步骤：步骤1：准备转化用载体；步骤2：准备微粒子弹；步骤3：基因枪轰击；步骤4：转换后培养、再生为植株。植物叶绿体表达技术是利用基因枪轰击、同源重组的方式将含有目标蛋白的质粒转移到植物叶绿体中，获得该基因植物叶绿体中高效表达的技术。与动物细胞表达系统相比，植物表达系统的成本非常低，仅为其千分之一到千分之二。本专利技术利用植物叶片，生产口服贫血性治疗胶囊。该贫血性治疗产品不需要注射，减轻病患的痛苦。生菜不含有植物有毒物质，而且本产品不需蛋白纯化流程，可以大大缩短生产周期和生产成本。本专利技术通过实验发现，植物系统尤其是生菜系统是更加经济、高效的表达平台，叶绿体可以高效的表达活性蛋白。由于生菜易于生长并且可商业上大量生产，因此比其它植物，如烟草等更容易获得并且更便宜，并且由于不需要复杂的特殊生产设备，成本可显著降低。综上所述，本专利技术可以利用生菜系统大规模生产EPO与转铁蛋白的融合蛋白。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示载体pEPO示意图；图2示western-blot结果。具体实施方式本专利技术公开了一种植物生产口服EPO与转铁蛋白融合蛋白胶囊的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术提供了植物作为宿主在表达EPO与转铁蛋白的融合蛋白的应用。优选的，所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.EPO与转铁蛋白的融合蛋白，其特征在于，其具有：(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或(Ⅱ)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或(III)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述序列至少有80％同源性的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.EPO与转铁蛋白的融合蛋白，其特征在于，其具有：(Ⅰ)、如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；或(Ⅱ)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或(III)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述序列至少有80％同源性的氨基酸序列。2.编码如权利要求1所述融合蛋白的核苷酸，其特征在于，具有(Ⅰ)、如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；或(Ⅱ)、如SEQID2所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或(IV)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(V)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)或(IV)所述核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。3.表达载体，其特征在于，包括如权利要求2所述的核苷酸以及待转化载体。4.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：王跃驹，
申请(专利权)人：王跃驹，
类型：发明
国别省市：美国,US