【技术实现步骤摘要】
一种评价弓形虫TgAtg8-TgAtg3蛋白相互作用分子特性的方法
本专利技术属于生物
，尤其是一种评价弓形虫TgAtg8-TgAtg3蛋白相互作用分子特性的方法。
技术介绍
刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)专性地寄生于人和动物的有核细胞内，引起人兽共患弓形虫病。全世界约有三分之一人群属于弓形虫隐性感染人群。人感染弓形虫后通常转化为缓慢生长的缓殖子期，表现为隐性感染，而当患者免疫力低下(如器官移植、肿瘤放疗、AIDS)时，缓殖子可转化为快速增殖的速殖子阶段，导致急性弓形虫病，严重时可致死亡。若孕妇感染可通过胎盘传给胎儿，导致流产、早产、死胎、畸胎、胎儿眼弓形虫病、先天性心脏病及智残儿。此外，弓形虫可感染其他哺乳类动物，如羊、猪、牛、鸡等，可致病畜死亡、流产等(如猪弓形虫病暴发时，整个猪场死亡率可高达60％以上)，给畜牧业带来巨大的经济损失。更重要的是，30％～63％的人群感染是通过食入含弓形虫包囊的肉类制品所致。在我国，家畜的弓形虫感染率可达10％～50％。可见，该病是我国一种常见的食源性、人兽共患性寄生虫病。目前，治疗弓形虫感染的药物主要包括...
【技术保护点】
1.一种评价弓形虫TgAtg8‑TgAtg3蛋白相互作用分子特性的方法，其特征在于：步骤如下：⑴无细胞蛋白表达检测：运用Gateway PCR技术构建六类重组质粒，在TgAtg3和TgAtg8蛋白的N端和C端分别融入GFP和Cherry荧光蛋白，构建为N‑GFP‑TgAtg3、N‑GFP‑TgAtg8、N‑Cherry‑TgAtg3、N‑Cherry‑TgAtg8、C‑TgAtg3‑Cherry和C‑TgAtg8‑Cherry六类重组质粒；将上述所得重组质粒与蜥蜴利什曼原虫无细胞表达系统混合，并加入重组核糖核酸酶抑制剂，总反应体系为10μl，具体如下：蜥蜴利什曼原虫无细胞表...
【技术特征摘要】
1.一种评价弓形虫TgAtg8-TgAtg3蛋白相互作用分子特性的方法，其特征在于：步骤如下：⑴无细胞蛋白表达检测：运用GatewayPCR技术构建六类重组质粒，在TgAtg3和TgAtg8蛋白的N端和C端分别融入GFP和Cherry荧光蛋白，构建为N-GFP-TgAtg3、N-GFP-TgAtg8、N-Cherry-TgAtg3、N-Cherry-TgAtg8、C-TgAtg3-Cherry和C-TgAtg8-Cherry六类重组质粒；将上述所得重组质粒与蜥蜴利什曼原虫无细胞表达系统混合，并加入重组核糖核酸酶抑制剂，总反应体系为10μl，具体如下：蜥蜴利什曼原虫无细胞表达系统：6μl；浓度为40U/μl的重组核糖核酸酶抑制剂：1μl；重组质粒：20nM；双蒸水补足体系至10μl，在27℃下表达2.5小时；将表达产物经SDS-PAGE电泳后在荧光成像系统下进行验证监测，确定有明显、且单一的目的条带后进行下一步操作；⑵AlphaScreen检测：将上述表达所得蛋白产物按以下方式进行两两分组，建立共表达体系进行AlphaScreen检测：第一组：GFP-TgAtg3与Cherry-TgAtg8；第二组：GFP-TgAtg8与Cherry-TgAtg3；第三组：GFP-TgAtg3与TgAtg8-Cherry；第四组：GFP-TgAtg8与TgAtg3-Cherry；第五组：GFP-TgAtg3与Cherry-TgAtg3；第六组：GFP-TgAtg3与TgAtg3-Cherry；第七组：GFP-TgAtg8与Cherry-TgAtg8；第八组：GFP-TgAtg8与TgAtg8-Cherry；首先运用无细胞蛋白表达系统，按照相同的办法将两类蛋白单独在27℃下表达15分钟，保证每一类蛋白质DNA最终浓度至少达到30nM；随后将分别带有GFP、Cherry融合蛋白的DNA表达产物以摩尔浓度比1:2的比例混合后共表达2.5小时；将表达产物在384孔板上与缓冲剂A混合，并且以十倍浓度梯度连续稀释，得稀释的表达产物；在暗室里分别先后加入受体和供体试剂，具体如下：①将抗Myc包被的受体珠加入缓冲剂B中，调整浓度为0.05μg/μl；②取12.5μl步骤①中试剂加入384孔板的每孔中，使每个孔中的受体珠含量为0.625μg；③加入2μl稀释的表达产物；④加入2μl浓度为50nM的生物素标记的GFP纳米颗粒，该GFP纳米颗粒使用缓冲液A稀释；⑤轻轻混匀，室温静置45分钟；⑥加入2μl缓冲剂A稀释的亲和素包被的、浓度为0.3125μg/μl的供体珠，混匀后再次室温静置45分钟；最后在Alpha信号收集系统下进行检测，获得相应信号值并进行数据分析，计算每组蛋白的结合指数并观察Alpha信号值变化曲线趋势，若曲线图呈现典型的正态分布，即：中间高、两端低，表明两者具有相互作用关系，若信号值即Y轴越高，表明两者结合能力越强，选择结合能力最强的蛋白组合进行后续实验；其中，所述缓冲剂A为：25mMHEPES缓冲液、50mM氯化钠、质量浓度为0.01％的乙基苯基聚乙二醇、质量浓度为0.01％的酪蛋白；所述缓冲剂B为：25mMHEPES缓冲液、50mM氯化钠、质量浓度为0.001％的乙基苯基聚乙二醇、质量浓度为0.001％的酪蛋白；⑶BIAcore亲和力检测：在原核表达系统中常规...
【专利技术属性】
技术研发人员：谭峰，胡昕，陈弟，刘淑贤，华倩倩，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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