本发明专利技术涉及一种评价弓形虫TgAtg8‑TgAtg3蛋白相互作用分子特性的方法，步骤如下：⑴无细胞蛋白表达检；⑵AlphaScreen检测；⑶BIAcore亲和力检测；⑷单分子光谱检测。本方法首先利用无细胞蛋白表达系统、AlphaScreen检测，BIAcore实验等体外实验验证两个蛋白的相互结合能力，进而采用单分子光谱技术阐明两个蛋白分子的相互结合规律，证实TgAtg8‑TgAtg3蛋白相互作用的具体比例为1:1，即1个TgAtg8和1个TgAtg3相结合，将既为弓形虫自噬系统研究提供新的理论依据，同时对于研发新的弓形虫病治疗药物具有重要的指导意义。
A Method for Evaluating Molecular Characteristics of Toxoplasma gondii TgAtg8-TgAtg3 Protein Interaction
【技术实现步骤摘要】
一种评价弓形虫TgAtg8-TgAtg3蛋白相互作用分子特性的方法
本专利技术属于生物
，尤其是一种评价弓形虫TgAtg8-TgAtg3蛋白相互作用分子特性的方法。
技术介绍
刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)专性地寄生于人和动物的有核细胞内，引起人兽共患弓形虫病。全世界约有三分之一人群属于弓形虫隐性感染人群。人感染弓形虫后通常转化为缓慢生长的缓殖子期，表现为隐性感染，而当患者免疫力低下(如器官移植、肿瘤放疗、AIDS)时，缓殖子可转化为快速增殖的速殖子阶段，导致急性弓形虫病，严重时可致死亡。若孕妇感染可通过胎盘传给胎儿，导致流产、早产、死胎、畸胎、胎儿眼弓形虫病、先天性心脏病及智残儿。此外，弓形虫可感染其他哺乳类动物，如羊、猪、牛、鸡等，可致病畜死亡、流产等(如猪弓形虫病暴发时，整个猪场死亡率可高达60％以上)，给畜牧业带来巨大的经济损失。更重要的是，30％～63％的人群感染是通过食入含弓形虫包囊的肉类制品所致。在我国，家畜的弓形虫感染率可达10％～50％。可见，该病是我国一种常见的食源性、人兽共患性寄生虫病。目前，治疗弓形虫感染的药物主要包括乙胺嘧啶、磺胺类制剂等化学药物，这些药物都存在副作用强、根治率低、疗程长等缺陷，且耐药株的报道也逐年增加。在现有的研究水平中，弓形虫自噬水平受经典的自噬调控药物所调控。然而，目前面临的最大困难在于：作为严格的胞内寄生性原虫，传统的自噬调控药物在干扰弓形虫自噬时，同样会干扰宿主细胞自噬。因此，寻找高效、副作用小的新药物靶点一直是本领域的研究重点。细胞自噬(autophagy)是普遍存在于真核生物中、一种高度保守的机制。当细胞在缺乏营养或发生应激反应(药物作用、免疫抑制等)时，可利用该通路清除或降解细胞内受损伤的细胞结构、衰老的细胞器以及不再需要的生物大分子等，同时为细胞内细胞器的构建或细胞结构的再循环提供原料。其中，自噬体形成是自噬发生的必要条件与物质基础，而该过程受多个自噬相关蛋白(Atg)的调控，尤其是Atg3催化Atg8与磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)结合形成稳定的自噬体膜结构是自噬体形成中的限速步骤。换言之，阻断Atg3与Atg8的相互作用可干扰自噬体的形成进而影响整个自噬进程。前期研究，已证实弓形虫体内存在TgAtg8-TgAtg3蛋白相互作用现象，但两个蛋白相互作用的具体比例尚不清楚。若证实两个蛋白相互作用的比例关系，将既为弓形虫自噬系统研究提供新的理论依据，同时对于研发新的弓形虫病治疗药物具有重要的指导意义。基于以上研究背景，本专利技术首先利用无细胞蛋白表达系统、AlphaScreen检测，BIAcore实验等体外实验验证两个蛋白的相互结合能力，进而采用单分子光谱技术阐明两个蛋白分子的相互结合规律。通过检索，发现如下两篇与本专利技术专利申请相关的专利公开文献：1、一种能够抑制弓形虫增殖的小分子抑制剂的筛选及应用方法(CN107884587A)，公开了一种能够抑制弓形虫增殖的小分子抑制剂的筛选方法，其利用Alphascreen实验初步选出11个小分子抑制剂和一个小分子促进剂，这12种药物都是临床用药。在细胞水平上对这12种药物进一步筛选，空斑实验证实GSKJ4HCL明显抑制了弓形虫的增殖并通过胞内增殖实验确定了它对弓形虫的EC50值在4.5μM左右。AlphaScreen竞争性抑制实验评估GSKJ4HCL抑制TgAtg8/TgAtg3相互作用的IC50值为11.01μM。利用CCK8实验证明了该药抑制宿主细胞生长的IC50值为34.359μM，远大于该药对虫体的EC50值，说明GSKJ4HCL是一个低毒且高效的抗弓形虫药物。2、公开了一种用于制备抑制弓形虫增殖的小分子抑制剂的应用，利用Alphascreen实验初步选出11个小分子抑制剂和一个小分子促进剂，这12种药物都是临床用药。在细胞水平上对这12种药物进一步筛选，空斑实验证实NVPAEW541明显抑制了弓形虫的增殖并通过胞内增殖实验确定了它对弓形虫的EC50值在1.27μM左右。AlphaScreen竞争性抑制实验评估NVPAEW541抑制TgAtg8/TgAtg3相互作用的IC50值为11.01μM。利用CCK8实验证明了该药抑制宿主细胞生长的IC50值为34.359μM，远大于该药对虫体的EC50值，说明NVPAEW541是一个低毒且高效的抗弓形虫药物。通过对比，本专利技术专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服以上提到的不足之处，提供一种评价弓形虫TgAtg8-TgAtg3蛋白相互作用分子特性的方法，该方法首先利用无细胞蛋白表达系统、AlphaScreen检测，BIAcore实验等体外实验验证两个蛋白的相互结合能力，进而采用单分子光谱技术阐明两个蛋白分子的相互结合规律，证实TgAtg8-TgAtg3蛋白相互作用的具体比例为1:1，即1个TgAtg8和1个TgAtg3相结合，将既为弓形虫自噬系统研究提供新的理论依据，同时对于研发新的弓形虫病治疗药物具有重要的指导意义。本专利技术解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：一种评价弓形虫TgAtg8-TgAtg3蛋白相互作用分子特性的方法，步骤如下：⑴无细胞蛋白表达检测：运用GatewayPCR技术构建六类重组质粒，在TgAtg3和TgAtg8蛋白的N端和C端分别融入GFP和Cherry荧光蛋白，构建为N-GFP-TgAtg3、N-GFP-TgAtg8、N-Cherry-TgAtg3、N-Cherry-TgAtg8、C-TgAtg3-Cherry和C-TgAtg8-Cherry六类重组质粒；将上述所得重组质粒与蜥蜴利什曼原虫无细胞表达系统混合，并加入重组核糖核酸酶抑制剂，总反应体系为10μl，具体如下：蜥蜴利什曼原虫无细胞表达系统：6μl；浓度为40U/μl的重组核糖核酸酶抑制剂：1μl；重组质粒：20nM；双蒸水补足体系至10μl，在27℃下表达2.5小时；将表达产物经SDS-PAGE电泳后在荧光成像系统下进行验证监测，确定有明显、且单一的目的条带后进行下一步操作；⑵AlphaScreen检测：将上述表达所得蛋白产物按以下方式进行两两分组，建立共表达体系进行AlphaScreen检测：第一组：GFP-TgAtg3与Cherry-TgAtg8；第二组：GFP-TgAtg8与Cherry-TgAtg3；第三组：GFP-TgAtg3与TgAtg8-Cherry；第四组：GFP-TgAtg8与TgAtg3-Cherry；第五组：GFP-TgAtg3与Cherry-TgAtg3；第六组：GFP-TgAtg3与TgAtg3-Cherry；第七组：GFP-TgAtg8与Cherry-TgAtg8；第八组：GFP-TgAtg8与TgAtg8-Cherry；首先运用无细胞蛋白表达系统，按照相同的办法将两类蛋白单独在27℃下表达15分钟，保证每一类蛋白质DNA最终浓度至少达到30nM；随后将分别带有GFP、Cherry融合蛋白的DNA表达产物以摩尔浓度比1:2的比例混合后共表达2.5小时；将表达产物在384孔板上与缓冲剂A混合，并且以十倍浓度梯度连续稀释，得稀释的表达产物；在暗室里本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种评价弓形虫TgAtg8‑TgAtg3蛋白相互作用分子特性的方法，其特征在于：步骤如下：⑴无细胞蛋白表达检测：运用Gateway PCR技术构建六类重组质粒，在TgAtg3和TgAtg8蛋白的N端和C端分别融入GFP和Cherry荧光蛋白，构建为N‑GFP‑TgAtg3、N‑GFP‑TgAtg8、N‑Cherry‑TgAtg3、N‑Cherry‑TgAtg8、C‑TgAtg3‑Cherry和C‑TgAtg8‑Cherry六类重组质粒；将上述所得重组质粒与蜥蜴利什曼原虫无细胞表达系统混合，并加入重组核糖核酸酶抑制剂，总反应体系为10μl，具体如下：蜥蜴利什曼原虫无细胞表达系统：6μl；浓度为40U/μl的重组核糖核酸酶抑制剂：1μl；重组质粒：20nM；双蒸水补足体系至10μl，在27℃下表达2.5小时；将表达产物经SDS‑PAGE电泳后在荧光成像系统下进行验证监测，确定有明显、且单一的目的条带后进行下一步操作；⑵AlphaScreen检测：将上述表达所得蛋白产物按以下方式进行两两分组，建立共表达体系进行AlphaScreen检测：第一组：GFP‑TgAtg3与Cherry‑TgAtg8；第二组：GFP‑TgAtg8与Cherry‑TgAtg3；第三组：GFP‑TgAtg3与TgAtg8‑Cherry；第四组：GFP‑TgAtg8与TgAtg3‑Cherry；第五组：GFP‑TgAtg3与Cherry‑TgAtg3；第六组：GFP‑TgAtg3与TgAtg3‑Cherry；第七组：GFP‑TgAtg8与Cherry‑TgAtg8；第八组：GFP‑TgAtg8与TgAtg8‑Cherry；首先运用无细胞蛋白表达系统，按照相同的办法将两类蛋白单独在27℃下表达15分钟，保证每一类蛋白质DNA最终浓度至少达到30nM；随后将分别带有GFP、Cherry融合蛋白的DNA表达产物以摩尔浓度比1:2的比例混合后共表达2.5小时；将表达产物在384孔板上与缓冲剂A混合，并且以十倍浓度梯度连续稀释，得稀释的表达产物；在暗室里分别先后加入受体和供体试剂，具体如下：①将抗Myc包被的受体珠加入缓冲剂B中，调整浓度为0.05μg/μl；②取12.5μl步骤①中试剂加入384孔板的每孔中，使每个孔中的受体珠含量为0.625μg；③加入2μl稀释的表达产物；④加入2μl浓度为50nM的生物素标记的GFP纳米颗粒，该GFP纳米颗粒使用缓冲液A稀释；⑤轻轻混匀，室温静置45分钟；⑥加入2μl缓冲剂A稀释的亲和素包被的、浓度为0.3125μg/μl的供体珠，混匀后再次室温静置45分钟；最后在Alpha信号收集系统下进行检测，获得相应信号值并进行数据分析，计算每组蛋白的结合指数并观察Alpha信号值变化曲线趋势，若曲线图呈现典型的正态分布，即：中间高、两端低，表明两者具有相互作用关系，若信号值即Y轴越高，表明两者结合能力越强，选择结合能力最强的蛋白组合进行后续实验；其中，所述缓冲剂A为：25mM HEPES缓冲液、50mM氯化钠、质量浓度为0.01％的乙基苯基聚乙二醇、质量浓度为0.01％的酪蛋白；所述缓冲剂B为：25mM HEPES缓冲液、50mM氯化钠、质量浓度为0.001％的乙基苯基聚乙二醇、质量浓度为0.001％的酪蛋白；⑶BIAcore亲和力检测：在原核表达系统中常规表达His6‑TgAtg8、His6‑TgAtg3融合蛋白；Western blot验证正确后大量表达、镍柱纯化及蛋白透析，将透析后样品液氮速冻后保存于‑80℃冰箱备用；将His6‑TgAtg3溶于醋酸钠溶液后偶联于CM5传感芯片；将His6‑TgAtg8蛋白进行两倍系列稀释，不同稀释倍数的His6‑TgAtg8蛋白样品按20μl/min流速通过His6‑TgAtg3蛋白感应芯片；反应结束后加入1M氯化镁溶液进行解离，解离时间设为150s；计算解离常数，评价两个蛋白相互作用亲和力；若两个蛋白的相互作用存在剂量依赖关系，表明两个蛋白真正存在相互作用关系；待AlphaScreen检测与BIAcore亲和力检测均证实两个蛋白存在相互作用关系后进行后续单分子光谱检测；⑷单分子光谱检测：根据AlphaScreen结果，选择N‑GFP‑TgAtg3和N‑Cherry‑TgAtg8配对，提高每一类蛋白质DNA最终浓度至40nM，并以相同的无细胞表达体系在体外表达3小时；暗室中，使用单分子光谱显微镜，将共表达蛋白置于激光共焦点，使它同时处于两类激光的刺激下，两类激光的波长分别为488nm和561nm；单分子光谱显微镜有两类信号输出通道，分别收集同一时间内同时通过该共焦点的蛋白质受到激光激动后所产生的光束，称之为GFP和Cherry信号；在测定过程中，不停地进行稀释至兆摩尔浓度，直到可以在单分子光谱仪...
【技术特征摘要】
1.一种评价弓形虫TgAtg8-TgAtg3蛋白相互作用分子特性的方法，其特征在于：步骤如下：⑴无细胞蛋白表达检测：运用GatewayPCR技术构建六类重组质粒，在TgAtg3和TgAtg8蛋白的N端和C端分别融入GFP和Cherry荧光蛋白，构建为N-GFP-TgAtg3、N-GFP-TgAtg8、N-Cherry-TgAtg3、N-Cherry-TgAtg8、C-TgAtg3-Cherry和C-TgAtg8-Cherry六类重组质粒；将上述所得重组质粒与蜥蜴利什曼原虫无细胞表达系统混合，并加入重组核糖核酸酶抑制剂，总反应体系为10μl，具体如下：蜥蜴利什曼原虫无细胞表达系统：6μl；浓度为40U/μl的重组核糖核酸酶抑制剂：1μl；重组质粒：20nM；双蒸水补足体系至10μl，在27℃下表达2.5小时；将表达产物经SDS-PAGE电泳后在荧光成像系统下进行验证监测，确定有明显、且单一的目的条带后进行下一步操作；⑵AlphaScreen检测：将上述表达所得蛋白产物按以下方式进行两两分组，建立共表达体系进行AlphaScreen检测：第一组：GFP-TgAtg3与Cherry-TgAtg8；第二组：GFP-TgAtg8与Cherry-TgAtg3；第三组：GFP-TgAtg3与TgAtg8-Cherry；第四组：GFP-TgAtg8与TgAtg3-Cherry；第五组：GFP-TgAtg3与Cherry-TgAtg3；第六组：GFP-TgAtg3与TgAtg3-Cherry；第七组：GFP-TgAtg8与Cherry-TgAtg8；第八组：GFP-TgAtg8与TgAtg8-Cherry；首先运用无细胞蛋白表达系统，按照相同的办法将两类蛋白单独在27℃下表达15分钟，保证每一类蛋白质DNA最终浓度至少达到30nM；随后将分别带有GFP、Cherry融合蛋白的DNA表达产物以摩尔浓度比1:2的比例混合后共表达2.5小时；将表达产物在384孔板上与缓冲剂A混合，并且以十倍浓度梯度连续稀释，得稀释的表达产物；在暗室里分别先后加入受体和供体试剂，具体如下：①将抗Myc包被的受体珠加入缓冲剂B中，调整浓度为0.05μg/μl；②取12.5μl步骤①中试剂加入384孔板的每孔中，使每个孔中的受体珠含量为0.625μg；③加入2μl稀释的表达产物；④加入2μl浓度为50nM的生物素标记的GFP纳米颗粒，该GFP纳米颗粒使用缓冲液A稀释；⑤轻轻混匀，室温静置45分钟；⑥加入2μl缓冲剂A稀释的亲和素包被的、浓度为0.3125μg/μl的供体珠，混匀后再次室温静置45分钟；最后在Alpha信号收集系统下进行检测，获得相应信号值并进行数据分析，计算每组蛋白的结合指数并观察Alpha信号值变化曲线趋势，若曲线图呈现典型的正态分布，即：中间高、两端低，表明两者具有相互作用关系，若信号值即Y轴越高，表明两者结合能力越强，选择结合能力最强的蛋白组合进行后续实验；其中，所述缓冲剂A为：25mMHEPES缓冲液、50mM氯化钠、质量浓度为0.01％的乙基苯基聚乙二醇、质量浓度为0.01％的酪蛋白；所述缓冲剂B为：25mMHEPES缓冲液、50mM氯化钠、质量浓度为0.001％的乙基苯基聚乙二醇、质量浓度为0.001％的酪蛋白；⑶BIAcore亲和力检测：在原核表达系统中常规...
【专利技术属性】
技术研发人员：谭峰，胡昕，陈弟，刘淑贤，华倩倩，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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