免疫原性缀合物及其用途制造技术

提供的技术处于这样的领域中：将天然的、非去污剂提取的外膜囊泡(nOMV)与抗原缀合以形成nOMV‑抗原缀合物，其特别可用于免疫原性组合物和免疫；还提供了制备和使用此类缀合物的方法。

Immunogenic conjugates and their applications

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】免疫原性缀合物及其用途本专利技术处于这样的领域中：将“天然的”、非去污剂提取的外膜囊泡(nOMV)与抗原缀合以形成nOMV-抗原缀合物的领域，其特别可用于免疫。
技术介绍
抗原与载体的缀合是用于改善免疫原性的确立的程序，尤其是对于糖。例如，细菌荚膜糖是天然T-细胞非依赖性抗原，其产生缺乏几种重要特性的免疫应答。与载体部分的缀合将这些糖转化为T-细胞依赖性抗原，其然后可以产生免疫记忆效应，并且还在幼儿中引发有效的免疫应答。此类缀合物中的蛋白载体的一种已知来源是来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的外膜蛋白复合物(OMPC)(例如参见EP-0467714,Merck&co.)，其已被包括在批准的流感嗜血杆菌B缀合疫苗中作为载体。OMPC也已被用作蛋白缀合物中的载体。根据现有技术，OMPC经由蛋白残基与抗原缀合，所述蛋白残基可以被活化或化学修饰，以便更好地与选择的抗原进行缀合。Wu等人(PNASUSA2006;103(48):18243–18248)报道了Pfs25H(一种人疟疾传播阻断蛋白)与OMPC的缀合产生Pfs25H-OMPC缀合物疫苗，其在小鼠中产生抗-Pfs25HELISA反应性方面的效力是类似剂量的单独的Pfs25H的>1,000倍。OMPC与Pfs25H蛋白的缀合可以通过使马来酰亚胺活化的Pfs25H与OMPC内的硫醇化外膜蛋白反应来实现(对于一般参考文献，参见例如WO2006/124712)，如方案1中所示。即使该过程可以代表有效的合成途径，所考虑的囊泡可能难以以纯的形式获得，并且它们通常经由费力的过程收集。而且，与选择的抗原的连接需要合适的囊泡蛋白的存在和活化，因此鉴于在囊泡分离期间使用去污剂或化学品(其可改变表面蛋白组成)，提出了额外的挑战。因此，仍然需要提供可用作免疫原性化合物的新缀合物，其克服了现有技术的问题，并且可通过简单且方便的程序实现。本申请人现已发现，当nOMV经由糖部分与选择的抗原连接时，因此获得的缀合物被赋予显著的免疫原性，并且可通过可靠且方便的方法获得，如下文更详细描述。专利技术概述在第一个方面，本专利技术涉及免疫原性nOMV-抗原缀合物，其包含通过无去污剂方法获得的天然、外膜囊泡(nOMV)，其至少具有与至少外来选择的抗原连接的天然表面糖部分。在一个进一步方面，本专利技术涉及用于制备所述缀合物的方法，其包括以下步骤：i)活化至少一个nOMV糖部分，其通常与nOMV表面键合，和ii)将因此获得的活化糖与至少一个选择的抗原连接。根据一个优选实施方案，nOMV-表面键合糖通过氧化活化，且然后与选择的抗原连接，更优选在还原胺化条件下。在一个额外方面，本专利技术还是指上述缀合物，其用作药物，特别是作为免疫原性化合物，或用于制备免疫原性组合物或疫苗。仍在一个进一步方面，本专利技术涉及免疫原性组合物或疫苗，其包含上述缀合物和至少一种药学上可接受的载体或佐剂；以及涉及用于产生脊椎动物中的免疫应答的方法，其包括施用所述组合物或疫苗。在一个进一步方面，本专利技术还是指nOMV用于制备免疫原性缀合物的用途。附图简述图1显示索氏志贺氏菌（S.sonnei）的-OAg结构。图2显示相比于与所述nOMV物理混合或与更传统载体CRM197缀合的fVi(用Alhydrogel配制)相比，用与鼠伤寒沙门氏菌（S.Typhimurium）nOMV缀合的片段化Vi(fVi)糖免疫之后的抗-Vi(图2A)和抗-OAg(图2B)IgG滴度。在第0天和第28天用1μgVi/剂量皮下免疫5周龄的CD1雌性小鼠(每组8只)。在第0、14、28和42天测量滴度。图3显示用与各种载体缀合的CTF1232多肽(用Alhydrogel配制)免疫之后的抗-CTF1232IgG滴度。在研究第0、21和38天，将5周龄的CD1雌性小鼠(每组8只)鼻内接种30μl疫苗(每个鼻孔15μl)。在第0、14、35和52天收集血清。剂量为0.5μgCTF1232。图4显示与单独的Pfs25或与所述nOMV物理混合的Pfs25相比，用与鼠伤寒沙门氏菌1418ΔtolRnOMV缀合的Pfs25多肽免疫之后的抗-Pfs25IgG滴度。在第0天和第28天用0.1μgPfs25/剂量(图4A，用Alhydrogel)或1μgPfs25/剂量(图4B，无Alhydrogel)皮下免疫5周龄的CD1雌性小鼠(每组8只)。在第0、14、28和42天测量滴度。图4C显示使用2和0.1μgPfs25/剂量(分别对应于10和0.5μgnOMV/剂量)(用Alhydrogel配制)的抗-OAgIgG滴度。再次，在第0天和第28天皮下免疫5周龄的CD1雌性小鼠(每组8只)。图5显示在用单独的RO6C或与鼠伤寒沙门氏菌1418ΔtolRnOMV囊泡缀合的RO6C免疫之后的抗-RO6CIgG滴度(图5A)和抗-OAgIgG滴度(图5B)。通过从第一缀合批次再循环未缀合的RO6C来制备再循环的缀合物。在第0天和第28天皮下免疫5周龄的CD1雌性小鼠(每组8只)，并且使用1、4和20μgRO6C的剂量。对于缀合物，nOMV的相应剂量分别为13μg、52μg和258μg(对于再循环的缀合物，4μgRO6C和32μgnOMV)。在第0、14、28和42天测量IgG滴度。图6a：根据本专利技术的实施方案，通过在有或没有猝灭反应的情况下缀合鼠伤寒沙门氏菌nOMV与Pfs25抗原产生的本专利技术的nOMV缀合物在小鼠中诱导的抗-Pfs25IgG应答(在第0天和第28天注射200μL/剂量SC，并且在第0、14、27和42天放血)。图6b：根据本专利技术的实施方案，通过在有或没有猝灭反应的情况下缀合鼠伤寒沙门氏菌nOMV与Pfs25抗原产生的本专利技术的nOMV缀合物在小鼠中诱导的抗-OAg应答(在第0天和第28天SC注射200μL/剂量，并且在第0、14、27和42天放血)。专利技术详述为了便于理解本专利技术，下面定义许多术语和短语。考虑本领域公认的以下术语和短语(包括过去、现在等时态)的同义词或替代词，即使没有具体描述。如在本公开和权利要求中所用，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数形式，除非上下文另有明确规定；即，“一个/种(a)”意指“一个/种或多个/种”，除非另有说明。术语“约”或“近似”意指大致、周围或其区域内。术语“约”或“近似”进一步意指如本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受的上下文误差范围内，其部分取决于如何测量或确定所述值，即，测量系统或特定目的(例如饲喂制剂内的营养素的量)所需的精度的限制。当术语“约”或“近似”结合数值范围使用时，它通过延伸所示数值的上限和下限而修改范围。例如，“在约0.2和5.0mg/ml之间”意味着数值范围的边界延伸低于0.2且高于5.0，使得所讨论的特定值实现与该范围内相同的功能结果。例如，“约”和“近似”可以意指根据本领域中的实践在1个或大于1个标准偏差内。或者，“约”和“近似”可以意指给定值的最多达20%、优选最多达10%、更优选最多达5%和更优选最多达1%的范围。如在短语诸如“A和/或B”中所使用的术语“和/或”旨在包括"A和B"、"A或B"、"A"和"B"。同样地，如短语诸如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”旨在涵本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含天然外膜囊泡(nOMV)的免疫原性缀合物，所述天然外膜囊泡(nOMV)具有与至少一种抗原连接的至少一种表面糖部分。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.25 GB 1619946.5;2017.07.27 GB 1712096.51.包含天然外膜囊泡(nOMV)的免疫原性缀合物，所述天然外膜囊泡(nOMV)具有与至少一种抗原连接的至少一种表面糖部分。2.根据权利要求1所述的免疫原性缀合物，其包含nOMV，所述nOMV具有与第一抗原连接的至少一种表面糖部分，其中所述第一抗原与第二不同抗原连接。3.根据权利要求1所述的免疫原性缀合物，其包含nOMV，所述nOMV具有与第一抗原连接的至少一种表面糖部分，和与第二不同抗原连接的至少另一种表面糖部分。4.根据权利要求1-3所述的免疫原性缀合物，其中所述nOMV通过无去污剂方法获得，其释放至发酵培养液中并使用离心和随后过滤进行纯化；或者释放至发酵培养液中并使用两个连续的切向流过滤(TFF)步骤进行纯化。5.根据前述权利要求所述的免疫原性缀合物，其中所述nOMV由野生型细菌或遗传修饰的细菌菌株产生，所述细菌菌株被突变以增强囊泡产生，并且任选地还除去或修饰抗原和/或过表达同源抗原或来自其他生物体的抗原。6.根据前述权利要求所述的免疫原性缀合物，其中所述nOMV获得自选自以下的细菌：奈瑟氏球菌、志贺氏菌、沙门氏菌肠血清变型、流感嗜血杆菌、霍乱弧菌、百日咳博德特氏菌、耻垢分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、大肠杆菌、拟杆菌、铜绿假单胞菌、幽门螺杆菌、马尔他布鲁氏菌、空肠弯曲杆菌、伴放线放线杆菌、嗜线虫致病杆病、粘膜炎莫拉氏菌或伯氏疏螺旋体。7.根据前述权利要求所述的免疫原性缀合物，其中所述抗原是免疫原性多肽或荚膜多糖。8.根据前述权利要求所述的免疫原性缀合物，其中所述nOMV和抗原源自相同或不同的细菌菌株。9.根据前述权利要求所述的免疫原性缀合物，其中所述nOMV和至少一种抗原选自如下：nOMV选择的抗原鼠伤寒沙门氏菌脑膜炎奈瑟氏球菌fHbp鼠伤寒沙门氏菌恶性疟原虫CSP鼠伤寒沙门氏菌恶性疟原虫Pfs25鼠伤寒沙门氏菌恶性疟原虫RO6C鼠伤寒沙门氏菌恶性疟原虫RO10C鼠伤寒沙门氏菌大肠杆菌CTF1232...

【专利技术属性】
技术研发人员：R阿尔菲尼，F米科利，AJ绍尔，
申请(专利权)人：葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司，
类型：发明
国别省市：比利时,BE