一种基于拉曼光谱测试果蔬组织中细胞水平水分含量和分布的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于拉曼光谱测试果蔬组织中细胞水平水分含量和分布的方法。包括样品的预处理、成像光谱的采集及其预处理、对成像光谱进行高斯分峰拟合并根据拟合结果进行伪彩成像、对细胞水平的水分含量及结合状态分布进行可视化并根据可视化图像。本发明专利技术首次完成了对果蔬组织中细胞水平的水分含量及结合状态的分布的可视化，并根据可视化成像获得了相对可靠的不同结合状态水分含量量化分析结果，可以作为一种新型的果蔬组织中细胞水平水分状态含量的测试方法，解决了目前果蔬加工过程中细胞水平水分变化无法检测的难题，对于果蔬加工的研究具有较好的前景。

A Raman Spectroscopy-based Method for Measuring Water Content and Distribution at Cellular Level in Fruit and Vegetable Tissues

【技术实现步骤摘要】
一种基于拉曼光谱测试果蔬组织中细胞水平水分含量和分布的方法
本专利技术属于光谱检测的
，具体涉及一种基于拉曼光谱测试果蔬组织中细胞水平水分含量和分布的方法。
技术介绍
果蔬作为人们日常生活不可缺少的食物之一，其水分含量高，但是由于其组织结构的不均匀性、多孔性、吸湿性等特点，水分在组织中的分布非常复杂。根据生物组织学的研究，我们通常认为果蔬中的大部分的水分分布在液泡、细胞质、细胞壁和胞外间隙中；而根据水分与组织中其他物质的结合程度，我们又将果蔬中的水分分为自由水、不易流动水和结合水，并且认为液泡和胞外间隙中的水为自由水，细胞质中的水为不易流动水，而细胞壁中的水为结合水。目前为了准确测量果蔬中不同结合状态水分的含量及分布情况，通常采用的方法有马林契可实验法、差式扫描量热法、差热分析法、生物阻抗分析法和低场核磁共振响应法。这些方法都各有优劣。马林契可实验法、差示扫描量热法和差热分析法都能够测定植物组织中结合水和自由水的含量，但是这些方法只能将测得的水分为两种即结合水和自由水，而无法更细致的区分出位于两者之间的不易流动水，并且无法区分这些水分布在细胞内还是细胞外；生物阻抗分析法可以测定出胞内水和胞外水的含量，但是无法对胞内水和胞外水的结合度进行评价；低场核磁共振法是目前测定自由水、不易流动水、结合水最方便快捷的方法，其可以根据样品中水的T2弛豫时间的长短来判断水与其他物质的结合程度，并最终将样品中的水分根据弛豫时间的长短分为自由水(弛豫时间最长)、不易流动水、结合水(弛豫时间最短)，并根据三者间的面积比确定样品中不同状态水分含量的比值，但是该方法同样无法提供不同状态水分的分布情况和位置信息，同时对于低场核磁共振响应法来说对样品中水分的含量做定量分析也是比较难的。因此，目前没有一种方法可以直接测定果蔬组织中细胞水平水分含量和水分分布情况。
技术实现思路
为解决现有技术的缺点和不足之处，本专利技术的目的在于提供一种基于拉曼光谱测试果蔬组织中细胞水平水分含量和分布的方法。该方法能够直观地对果蔬组织中细胞水平的水分分布和含量状况进行成像和量化分析，从而准确地获得果蔬组织中不同状态水分(即自由水、不易流动水、结合水)的位置信息及其含量信息。本专利技术目的通过以下技术方案实现：一种基于拉曼光谱测试果蔬组织中细胞水平水分含量和分布的方法，包括以下步骤：(1)取待测果蔬切成样品；(2)将样品置于激光共聚焦显微镜的载物台上进行成像光谱采集，具体是通过激光共聚焦显微镜物镜从样品中选取细胞区域，然后将所选细胞区域进行网格划分得到均匀分布的交点，标记每个交点在所选细胞区域中的相应坐标信息，对每个交点处进行扫描，得到细胞区域中各个交点处对应水分的拉曼光谱；其中网格步长为3～5μm；(3)将步骤(2)得到的拉曼光谱进行平滑降噪和去除荧光背景处理，然后进行高斯分峰拟合，每个拉曼光谱均得到位于3000～3800cm-1处的5个子峰和位于2700～3000cm-1处的2～3个子峰；(4)将每个拉曼光谱分峰后位于3000～3800cm-1处的5个子峰的峰面积进行加和，得到细胞区域中该交点处对应水分含量A；根据中心位于3410～3440cm-1处的子峰峰面积与中心位于3200～3220cm-1处的子峰峰面积的比值R判断该交点处对应水分子的结合状态；(5)结合各个交点的坐标信息，分别以所有交点处对应水分含量A和比值R为像素点进行伪彩化成像，得到果蔬组织细胞水平的水分含量和水分结合状态分布状况。步骤(1)所述果蔬优选为苹果、土豆、葡萄、梨和白菜茎中的一种。步骤(1)所述样品为去皮的果蔬，样品的形状优选为圆片状，其尺寸根据测试前及测试过程中用于存放样品的仪器决定，优选为直径×厚度＝12mm×2mm。步骤(1)所述样品在测试前及测试过程中优选保存在石英腔中，所述石英腔的腔体温度为2～10℃，湿度大于80％，其中石英腔的腔体用厚度为0.3mm的石英盖玻片密封。目的在于使测试过程中样品在环境中的水分蒸发几乎可以忽略不计，从而可以保持测试过程中样品水分含量的稳定性。步骤(2)所述细胞区域大小由细胞大小决定，常规果蔬细胞的平均直径在100～300μm之间。步骤(2)所述成像光谱采集的深度优选为50～100μm，该深度可以最大限度降低切片过程对组织细胞中水分含量的影响，同时也能够深入细胞内部，测得细胞内部水分的分布。步骤(2)所述成像光谱采集所用的激光器优选为532nm激光器，其中光栅的大小为600gr/mm，Hole为500，扫描范围为2700～3800cm-1；采集的条件优选为：采集时间3～5s，累积次数2～3次，激光能量的衰减为25～50％。步骤(2)所述物镜的倍数优选为10倍。步骤(3)所述平滑降噪处理优选采用matlab软件中的smooth函数，选择Savitzky-golay卷积平滑算法；所述去除荧光背景处理优选采用自适应迭代重加权惩罚最小二乘背景扣除算法(airPLS算法)。步骤(3)所述高斯分峰拟合的方法优选为采用matlab软件运用peakfit函数进行。所述peakfit函数是一种以高斯方程为峰形的非线性迭代曲线拟合函数，可以通过调节迭代次数、峰形和峰位获得最大的拟合决定系数。步骤(3)所述高斯分峰拟合优选为定峰位高斯分峰拟合，即采用定峰位高斯迭代曲线拟合算法，在固定峰位的情况下对光谱进行高斯曲线拟合；其峰位的确定方法如下：随机选取50个拉曼光谱，利用peakfit软件对其进行迭代分峰处理，将每个拉曼光谱分为7～8个子峰，然后将50个拉曼光谱得到的子峰峰位信息进行平均化，得到7～8个子峰的平均峰位信息，以此作为定峰位高斯分峰的峰位依据。所述peakfit软件更优选为peakfitv4.12软件。步骤(3)所述位于2700～3000cm-1处的2～3个子峰为碳水化合物的CH-伸缩振动峰；位于3000～3800cm-1处的5个子峰为水分子OH-在氢键作用下产生的伸缩振动峰，5个子峰分别对应具有不同氢键的水分子。步骤(3)所述高斯分峰拟合还可得到分峰拟合的决定系数和拟合光谱与原光谱的相对误差。步骤(4)所述位于3000～3800cm-1处的5个子峰的峰面积之和代表了步骤(2)所述交点处对应水分子的含量，即水分的含量，因此可以表征该交点处水分含量；中心位于3410～3440cm-1处的子峰峰面积与中心位于3200～3220cm-1处的子峰峰面积的比值R，可以反映水分子氢键的结合情况，从而进一步反映水分子的结合程度，其中比值越小，水分子结合度越大，比值越大，水分子的自由度越高。步骤(5)所述伪彩化成像优选采用matlab软件进行，运用pcolor和colormap函数方法，其中shading方式为shadinginterp，以水分含量A为像素点做的伪彩图实现了细胞水平水分含量的可视化，以比值R为像素点做的伪彩图实现了水分结合状态细胞水平的可视化。本专利技术中拉曼光谱高分辨率的特性可以捕捉到分子间或分子内氢键的细微变化，氢键的细微变化易受到外界环境的影响，如温度、压力、离子浓度和空间大小等，因此可以用于水分子结构的研究。水分子的拉曼光谱是一个具有两个明显凸起的宽峰，两个凸起的中心分别位于3240cm-1和3440cm-1附近，这两个凸起的相对大小与氢键的变本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于拉曼光谱测试果蔬组织中细胞水平水分含量和分布的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取待测果蔬切成样品；(2)将样品置于激光共聚焦显微镜的载物台上进行成像光谱采集，具体是通过激光共聚焦显微镜物镜从样品中选取细胞区域，然后将所选细胞区域进行网格划分得到均匀分布的交点，标记每个交点在所选细胞区域中的相应坐标信息，对每个交点处进行扫描，得到细胞区域中各个交点处对应水分的拉曼光谱；其中网格步长为3～5μm；(3)将步骤(2)得到的拉曼光谱进行平滑降噪和去除荧光背景处理，然后进行高斯分峰拟合，每个拉曼光谱均得到位于3000～3800cm

【技术特征摘要】
1.一种基于拉曼光谱测试果蔬组织中细胞水平水分含量和分布的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取待测果蔬切成样品；(2)将样品置于激光共聚焦显微镜的载物台上进行成像光谱采集，具体是通过激光共聚焦显微镜物镜从样品中选取细胞区域，然后将所选细胞区域进行网格划分得到均匀分布的交点，标记每个交点在所选细胞区域中的相应坐标信息，对每个交点处进行扫描，得到细胞区域中各个交点处对应水分的拉曼光谱；其中网格步长为3～5μm；(3)将步骤(2)得到的拉曼光谱进行平滑降噪和去除荧光背景处理，然后进行高斯分峰拟合，每个拉曼光谱均得到位于3000～3800cm-1处的5个子峰和位于2700～3000cm-1处的2～3个子峰；(4)将每个拉曼光谱分峰后位于3000～3800cm-1处的5个子峰的峰面积进行加和，得到细胞区域中该交点处对应水分含量A；根据中心位于3410～3440cm-1处的子峰峰面积与中心位于3200～3220cm-1处的子峰峰面积的比值R判断该交点处对应水分子的结合状态；(5)结合各个交点的坐标信息，分别以所有交点处对应水分含量A和比值R为像素点进行伪彩化成像，得到果蔬组织细胞水平的水分含量和水分结合状态分布状况。2.根据权利要求1所述一种基于拉曼光谱测试果蔬组织中细胞水平水分含量和分布的方法，其特征在于，步骤(2)所述成像光谱采集所用的激光器为532nm激光器，其中光栅的大小为1200gr/mm，Hole为500，扫描范围为2700～3800cm-1；采集的条件为：采集时间3～5s，累积次数2～3次，激光能量的衰减为25～50％。3.根据权利要求1所述一种基于拉曼光谱测试果蔬组织中细胞水平水分含量和分布的方法，其特征在于，步骤(2)所述成像光谱采集的深度为50～100μm。4.根据权利要求1或2或3所述一种基于拉曼光谱测试果蔬组织中细胞水平水分含量和分布的方法，其特征在于，步骤(3)所述高斯分峰拟合的方法为采用matlab软件运用peakfit...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙大文，李冬梅，朱志伟，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44