泡盛曲霉β-1,3-1,4-葡聚糖酶的表达纯化方法技术

本发明专利技术公开了泡盛曲霉β‑1,3‑1,4‑葡聚糖酶的表达纯化方法。本发明专利技术提供了一种生产β‑1,3‑1,4‑葡聚糖酶的方法，包括将泡盛曲霉β‑1,3‑1,4‑葡聚糖酶编码基因导入受体酵母；将重组酵母于BSM培养基培养，待甘油消耗完全进行甘油补料发酵阶段、甲醇补料诱导表达阶段和混合补料诱导表达阶段。本发明专利技术工程菌经高密度发酵，发酵液酶活可达159500U/mL(蛋白含量31.7mg/mL)。所产β‑1,3‑1,4‑葡聚糖酶最适pH5.0，在pH 2.0‑9.0保持稳定；最适温度55℃，在60℃以下保持高酶活力；底物特异性专一。本发明专利技术在食品、饲料等行业具有应用价值。

Expression and Purification of Aspergillus Paoshensis Beta-1,3-1,4-glucanase

【技术实现步骤摘要】
泡盛曲霉β-1,3-1,4-葡聚糖酶的表达纯化方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种泡盛曲霉β-1,3-1,4-葡聚糖酶的表达纯化方法。
技术介绍
β-葡聚糖酶是一类能够降解谷物中β-葡聚糖的酶类，包括β-1,3-1,4-葡聚糖酶(地衣多糖酶，EC3.2.1.73)、β-1,4-葡聚糖酶(纤维素酶，EC3.2.1.4)、β-1,3-葡聚糖酶(昆布多糖酶，EC3.2.1.39)和β-1,3(4)-葡聚糖酶(EC3.2.1.6)(专利号：CN201410246941，申请日：20140530)。其中，β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有严格的底物特异性，其水解β-葡聚糖的3-O-取代葡萄糖残基上的β-1,4-糖苷键，生成主要包含3-O-β-纤维二糖基-D-葡萄糖和3-O-β-纤维三糖基-D-葡萄糖的水解产物(专利号：CN201610416008，申请日：20160614；Yangetal.,JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2008,56:5345-5351)。β-1,3-1,4-葡聚糖酶广泛应用于啤酒生产和饲料工业中。在啤酒生产中，β-1,本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产β‑1,3‑1,4‑葡聚糖酶的方法，包括如下步骤：(A)将来源于泡盛曲霉的β‑1,3‑1,4‑葡聚糖酶的编码基因导入受体酵母，得到重组酵母；(B)按照如下步骤对所述重组酵母进行发酵培养，从发酵产物中获得β‑1,3‑1,4‑葡聚糖酶：B1)基础发酵培养：将所述重组酵母接种于BSM培养基中培养，待甘油消耗完全进行甘油补料发酵阶段；B2)甘油补料发酵阶段：在步骤B1)的基础上，将甘油以30mL/h/L起始发酵液的速度流加到发酵体系中，流加4h，待甘油消耗完全后饥饿1h，然后进行甲醇补料诱导表达阶段；B3)甲醇补料诱导表达阶段：在步骤B2)的基础上，将甲醇以6mL/h/L起始发酵液的速度加...

【技术特征摘要】
1.一种生产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的方法，包括如下步骤：(A)将来源于泡盛曲霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的编码基因导入受体酵母，得到重组酵母；(B)按照如下步骤对所述重组酵母进行发酵培养，从发酵产物中获得β-1,3-1,4-葡聚糖酶：B1)基础发酵培养：将所述重组酵母接种于BSM培养基中培养，待甘油消耗完全进行甘油补料发酵阶段；B2)甘油补料发酵阶段：在步骤B1)的基础上，将甘油以30mL/h/L起始发酵液的速度流加到发酵体系中，流加4h，待甘油消耗完全后饥饿1h，然后进行甲醇补料诱导表达阶段；B3)甲醇补料诱导表达阶段：在步骤B2)的基础上，将甲醇以6mL/h/L起始发酵液的速度加流到发酵体系中，流加甲醇至菌体湿重达320g/L时停止流加；B4)混合补料诱导表达阶段：在步骤B3)的基础上，将甲醇以4-5mL/h/L起始发酵液的速度，甘油以90mL/h/L起始发酵液的速度同时流加到发酵体系中，流加至发酵结束。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(A)中，所述来源于泡盛曲霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶为如下任一所示蛋白质：a1)SEQIDNo.1自N末端第17至239位氨基酸残基组成的蛋白质；a2)由SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。a3)将a1)或a2)所述的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性的蛋白质。a4)与a1)-a3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性的蛋白质；a5)在a1)-a4)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(A)中，所述来源于泡盛曲霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的编码基因是通过重组载体的形式导入所述受体酵母中的。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体1或重组表达载体2；所述重组表达载体1为将表达盒1按照顺式-反式-顺式依次串联然后克隆到pPIC9K载体的多克隆位点后得到的重组质粒；所述表达盒1由2×AOX1启动子、α-factor信号肽的编码基因、所述来源于泡盛曲霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的编码基因和AOX1终止子顺次连接而成；进一步地，所述α-factor信号肽的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；所述2×AOX1启动子的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述AOX1终止子的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；所述重组表达载体2为将所述来源于泡盛曲霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的编码基因插入到pPIC9K载体的多克隆位点后得到的重组质粒。5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述酵母为毕赤酵母；进一步地，所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：步骤(A)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫巧娟，江正强，刘学强，杨绍青，马帅，余静，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11