制备抗体-链霉亲和素偶联物的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种制备抗体‑链霉亲和素偶联物的方法。该方法包括：将抗体和还原剂接触，获得经还原的含有巯基的抗体；将所述经还原的含有巯基的抗体和马来酰亚胺修饰的链霉亲和素接触，以便获得所述抗体‑链霉亲和素偶联物。本发明专利技术提供的抗体‑链霉亲和素偶联物的制备方法简单快速，而且方便可控。

Preparation of antibody-streptavidin conjugates

【技术实现步骤摘要】
制备抗体-链霉亲和素偶联物的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种制备抗体-链霉亲和素偶联物的方法。
技术介绍
随着肿瘤治疗技术的不断进步和发展，个性化用药和靶向治疗所占的比重越来越大；而这其中的关键是预靶输送系统。“预靶”技术指利用抗体-链霉亲和素偶联物将有治疗作用的放射性物质定位到肿瘤部位。抗体使偶联物能定位在带有抗原的疾病部位；链霉亲和素捕获生物素与放射性核素螯合物。然而获取抗体-链霉亲和素偶联物的方法还需要进一步改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种制备抗体-链霉亲和素偶联物的方法。具体而言，本专利技术提供了如下技术方案：在本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种制备抗体-链霉亲和素偶联物的方法，包括：将抗体和还原剂进行第一接触反应，以便获得经还原的含有巯基的抗体；将所述经还原的含有巯基的抗体和马来酰亚胺修饰的链霉亲和素进行第二接触反应，以便获得所述抗体-链霉亲和素偶联物。在本专利技术所提供的制备抗体-链霉亲和素偶联物的方法中，将抗体和还原剂反应，使得抗体中的二硫键被还原，产生活性硫醇，即经还原的含有巯基的抗体；然后与马来酰亚胺修饰的链霉亲和素进行反应，从而可以获得抗体-链霉亲和素偶联物。该抗体-链霉亲和素偶联物的制备方法简单快速，而且方便可控。本专利技术所提供的制备抗体-链霉亲和素偶联物的方法，可以持续产生质量合格数量足够的偶联物用于预靶传送系统的临床发展和评价。而且，所获得的抗体-链霉亲和素偶联物不仅仅可以运用于预靶输送系统，用于肿瘤预定位显像和治疗；也可以运用于亲和层析等分离纯化应用；同样可以运用于免疫诊断技术，例如侧向流层析试纸条这种灵敏度较低的检测方法，可以极大的提高检测的灵敏度。根据本专利技术的实施例，以上所述制备抗体-链霉亲和素的方法可以进一步包括如下技术特征：在本专利技术的一些实施例中，所述将还原的含有巯基的抗体和所述马来酰亚胺修饰的链霉亲和素的质量比为2～5：1，优选为2～4:1，更优选为3：1。在该条件下进行偶联，所得到的产物中抗体和链霉亲和素至少有90％以上的抗体-链霉亲和素是按照摩尔比例为1:1和1:2的比例结合，这些偶联物方便可以用于预靶传送系统。在本专利技术的一些实施例中，将所述经还原的含有巯基的抗体和所述马来酰亚胺修饰的链霉亲和素在室温下进行第二接触反应30～60分钟，以便获得所述抗体-链霉亲和素偶联物。在本专利技术的一些实施例中，每个所述经还原的含有巯基的抗体中带有9-12个所述巯基。每个经还原的抗体中带有9～12个左右的巯基，经还原的抗体和马来酰亚胺修饰的链霉亲和素进行偶联，可以获得纯度至少90％以上的抗体-链霉亲和素偶联物，这些抗体-链霉亲和素偶联物中多数是抗体和链霉亲和素摩尔比为1:1的抗体-链霉亲和素偶联物，也含有少数抗体和链霉亲和素摩尔比为1:2的抗体-链霉亲和素偶联物。例如使用50毫摩尔DTT还原PSA可形成9-12个活性硫醇。还原性PSA能在结合反应前25℃保存超过8h而且活性硫醇没有显著损失。当二硫键被还原，非共价键作用维持重-重和重-轻链的缔合。在本专利技术的一些实施例中，所述还原剂为二硫苏糖醇(DTT)。DTT与巯基乙醇作用相似，是巯基化DNA的还原剂和去保护剂，也用于还原蛋白质中二硫键，有抗氧化作用。DTT的刺激性气味和毒性比巯基乙醇低很多。而且DTT比巯基乙醇的还原能力要强，当其浓度比巯基乙醇低7倍时，两者还原效果相近。在本专利技术的一些实施例中，将所述抗体和所述还原剂在室温下进行第一接触反应20～50分钟，利用30KD的超滤离心管进行过滤处理，以便获得所述经还原的含有巯基的抗体。在本专利技术的一些实施例中，在4摄氏度下采用10000～15000转/分钟离心，进行所述过滤处理。在本专利技术的一些实施例中，所述方法进一步包括：将链霉亲和素和SMCC进行第三接触反应，以便获得所述马来酰亚胺修饰的链霉亲和素。在本专利技术的一些实施例中，所述链霉亲和素和所述SMCC的摩尔比为1：2～5，优选为1:2～4，更优选为1：3。选择SMCC作为交联剂是因为它反应迅速、可定量且具有相比其它交联剂更好的稳定性。SMCC功能化的SA可无限期冻存在-70摄氏度条件下。SMCCcrosslinker(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸-N-琥珀酰亚胺酯)作为一种具有马来酰亚胺基团的异官能团蛋白质交联剂，即巯基反应和NHS酯基团的胺反应性。SMCC的9原子间隔臂是不可裂解的。环己烷桥为马来酰亚胺基团赋予了额外的稳定性，这使得SMCC成为马来酰亚胺激活蛋白的理想交联试剂。马来酰亚胺能够在pH6.5-7.5的条件下与巯基发生反应，形成稳定的硫醚键。由于间隔臂中含有环己烷桥，SMCC的马来酰亚胺基团甚至在pH7.5条件下都具有极好的稳定性。在本专利技术的一些实施例中，将所述链霉亲和素和所述SMCC在室温下进行第三接触反应30～60分钟，利用30KD的超滤离心管进行过滤处理，以便获得所述马来酰亚胺修饰的链霉亲和素。在本专利技术的一些实施例中，在4摄氏度采用10000～15000转/分钟离心，进行所述过滤处理。根据本专利技术的第二方面，本专利技术提供了一种制备抗体-链霉亲和素的方法，包括：将抗体和二硫苏糖醇在室温下进行第一接触反应20～50分钟，以便获得经还原的含有巯基的抗体；将链霉亲和素和SMCC在室温下进行第三接触反应30～60分钟，以便获得马来酰亚胺修饰的链霉亲和素；将所述经还原的含有巯基的抗体和所述马来酰亚胺修饰的链霉亲和素在室温下进行第二接触反应30～60分钟，以便获得所述抗体-链霉亲和素，所述经还原的含有巯基的抗体和所述马来酰亚胺修饰的链霉亲和素的质量比为2～5：1，优选为3:1。在本专利技术的一些实施例中，在第二接触反应进行30～60分钟后，加入连四硫酸钠溶液终止所述第二接触反应，然后利用蛋白亲和磁珠进行纯化处理，以便获得所述抗体-链霉亲和素。在本专利技术的一些实施例中，在所述第一接触反应进行20～50分钟后，利用30kD的超滤离心管在4摄氏度下10000～15000转/分钟离心，以便获得所述经还原的含有巯基的抗体；在所述第二接触反应进行30～60分钟后，利用30kD的超滤离心管在4摄氏度下采用10000～15000转/分钟离心处理，以便获得马来酰亚胺修饰的链霉亲和素。附图说明图1是根据本专利技术的实施例提供的抗体和链霉亲和素的偶联示意图。图2是根据本专利技术的实施例提供的PSA抗体偶联链霉亲和素后和未偶联链霉亲和素的免疫活性对比结果。图3是根据本专利技术的实施例提供的经过不同摩尔比例的SMCC活化的SA与PSA抗体偶联后的凝胶电泳检测结果图。图4是根据本专利技术的实施例提供的不同质量比的SMCC-SA和PSA偶联后的凝胶电泳检测结果图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。链霉亲和素(streptavidin，SA)是由链霉菌streptomycesavidinii分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物素，并且本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备抗体‑链霉亲和素偶联物的方法，其特征在于，包括：将抗体和还原剂进行第一接触反应，以便获得经还原的含有巯基的抗体；将所述经还原的含有巯基的抗体和马来酰亚胺修饰的链霉亲和素进行第二接触反应，以便获得所述抗体‑链霉亲和素偶联物。

【技术特征摘要】
1.一种制备抗体-链霉亲和素偶联物的方法，其特征在于，包括：将抗体和还原剂进行第一接触反应，以便获得经还原的含有巯基的抗体；将所述经还原的含有巯基的抗体和马来酰亚胺修饰的链霉亲和素进行第二接触反应，以便获得所述抗体-链霉亲和素偶联物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将还原的含有巯基的抗体和所述马来酰亚胺修饰的链霉亲和素的质量比为2～5：1，优选为2～4:1，更优选为3：1。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述经还原的含有巯基的抗体和所述马来酰亚胺修饰的链霉亲和素在室温下接触反应30～60分钟，以便获得所述抗体-链霉亲和素偶联物。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每个所述经还原的含有巯基的抗体中带有9～12个所述巯基。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述还原剂为二硫苏糖醇；任选地，将所述抗体和所述还原剂在室温下接触反应20～50分钟，利用30KD的超滤离心管进行过滤处理，以便获得所述经还原的含有巯基的抗体；任选地，在4摄氏度下采用10000～15000转/分钟离心，进行所述过滤处理。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：将链霉亲和素和SMCC进行第三接触反应，以便获得所述马来酰亚胺修饰的链霉亲和素。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述链霉亲和素和所述SMCC的摩尔比为1：2～5，优选为：1:2～4，更优选为1：3；任选地，将所述链霉...

【专利技术属性】
技术研发人员：常文伟，李印军，艾峰，
申请(专利权)人：深圳优普生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44