本发明专利技术提供了本发明专利技术涉及一种地肤花粉变应原浸提物、其浸提液及其制备方法，地肤花粉变应原浸提物其含有致敏蛋白Koc S1’，其含有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。该地肤花粉变应原浸液，其含有治疗有效量或诊断有效量的地肤花粉变应原。该浸液还可经地肤花粉收集、干燥、脱脂、提取、超滤浓缩、冷冻干燥、复溶等工艺方法制得。该地肤花粉变应原浸液具有特异性高的特点，地肤致敏蛋白组分提取充分，总生物效价稳定，有效期长，无菌效果好；可有效用于变态反应疾病的皮肤点刺试验诊断、体外嗜碱性粒细胞活化试验诊断及特异性免疫治疗，可有效诊断由地肤花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。
A pollen allergen extract, its extract and its preparation method
【技术实现步骤摘要】
一种地肤花粉变应原浸提物、其浸提液及其制备方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种地肤花粉变应原浸提物、其浸提液及其制备方法。
技术介绍
人们对变态反应疾病的认识始于“花粉热”，花粉热又称过敏性鼻炎。1911年Noon和Freeman首次利用花粉提取液来治疗花粉热，变态原疾病治疗的历史从此开始。目前，变态反应性疾病是全球性重大卫生问题之一。工业化国家超过25％的人口被变应性哮喘、变应性鼻结膜炎及变应性皮炎困扰，其中以变应性哮喘最为常见。吸入致敏花粉是引发变应性哮喘及其他呼吸道变态反应性疾病的最重要因素。VRTA—L.A等调查发现近50％的变态反应性疾病患者对草类花粉过敏。叶筱燕的《130例慢性荨麻疹点刺试验结果分析》指出130例慢性荨麻疹对吸入物抗原测试反应结果中，地肤花粉阳性率为17.69％；郝玉琴的《皮肤点刺试验检测慢性荨麻疹、湿疹变应原的临床意义》指出186例慢性荨麻疹、湿疹病人吸入物变应原检测阳性结果，地肤占7.5％；潘武林的《63例慢性荨麻疹变应原皮肤检测分析》得出63例慢性荨麻疹患者吸入变应原检测阳性结果，地肤花粉占7.1％。以上地肤花粉流行病学调查研究显示，地肤花粉过敏广泛分布在我国各地，在北方地区地肤花粉是花粉过敏的主要致敏原。地肤(Kochiascoparia(L.)Schrad.)属中央种子目地肤属，地肤适应性较强，喜温、喜光、耐干旱，不耐寒，对土壤要求不严格，较耐碱性土壤。肥沃、疏松、含腐殖质多的壤土利于地肤旺盛生长原产于欧洲及亚洲中部和南部地区。分布在亚洲、欧洲以及中国大陆的大部分地区。国外分布：北非、非洲、欧洲、亚洲、中欧、俄罗斯西伯利亚地区、俄罗斯西西伯利亚地区、俄罗斯远东地区、乌苏里、则亚-布列亚、中亚地区。现在变应原特异免疫治疗的方法主要分为皮下注射给药免疫治疗和舌下给药免疫治疗。皮下注射给药免疫治疗已有100多年历史，其安全性和有效性已经被得到证明。上世纪90年代初，变应原舌下滴剂疫苗诞生，1998年，WHO宣布了变应原舌下滴剂疫苗安全和有效。但是舌下给药免疫脱敏的方式相比皮下注射免疫给药，治疗周期长，短时间内疗效不显著，平均脱敏周期3-5年。在一个治疗周期中，舌下给药方式免疫脱敏给药量是皮下注射给药量的100倍。所以皮下注射给药免疫脱敏的方式相比舌下给药，虽然病人依从性差，但是治疗周期短，见效快，治疗费用低。目前，用于地肤花粉变应原的作为皮下注射免疫制剂的稳定性差，蛋白含量和生物效价都会随时间下降，成分不确定试剂存放一定时间后用于诊断地肤花粉诱发的变态反应疾病时，阳性率降低，准确性低。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种含地肤花粉变应原浸物，该浸物具有于特异性高，地肤致敏蛋白组分提取充分且比例恒定，总生物效价稳定，有效期长的特点。其可有效用于变态反应疾病的皮肤点刺试验诊断及特异性免疫治疗，可有效诊断由地肤花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案为：一种地肤花粉变应原浸物，其含有致敏蛋白KocS1’；所述KocS1’含有如SEQIDNO.4所示的氨基酸序列。一种地肤花粉变应原浸液，其含有治疗有效量或诊断有效量的地肤花粉变应原、体积比为0.2～0.4％的苯酚，体积比为45～55％的甘油和4.5～5.5g/L的NaCl，其pH值为6.0～8.0。如上所述的地肤花粉变应原浸液，优选地，所述地肤花粉变应原的活性浓度为50000～200000BAU/ml，所述地肤花粉变应原浸液的总蛋白浓度0.28～1.12mg/ml。进一步地，通过SDS-PAGE和WesternBlotting检测，所述地肤花粉变应原的蛋白分布主要在11kDa、14.5kDa、18kDa、28kDa、42kDa、68kDa、72kDa、85kDa和115kDa。如上所述的地肤花粉变应原浸液，优选地，通过全蛋白质谱或经SDS-PAGE分离后将对应分子量胶条分别取样进行质谱检测，所述地肤花粉变应原浸提物主要含且不限于如SEQIDNO.6-SEQIDNO.17所示的特征性肽段。如上所述的地肤花粉变应原浸液的制备方法，其包括如下步骤：S1、采集地肤花粉，常温干燥真空干燥或流化床干燥；S2、对干燥后的花粉脱脂、干燥；S3、将脱脂干燥后的地肤花粉按重量g体积ml比1:50～1:10加入pH为7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2～8℃搅拌22～26h进行浸提；S4、取步骤S3后的浸提液，离心取上清液；将上清液过滤及除菌过滤；S5、将过滤后的上清液进行超滤浓缩，获得超滤浓缩液；S6、将所述超滤浓缩液经过二次过滤和除菌过滤后，真空冻干获得地肤花粉变应原冻干品；S7、将所述地肤花粉变应原冻干品用pH6.5～7.5磷酸盐—盐水缓冲液复溶配置为地肤花粉变应原原液，2～8℃放置，与等体积灭菌的甘油混匀，调节溶液pH值至6.0～8.0。如上所述的制备方法，优选地，在步骤S2中，所述花粉脱脂采用花粉与丙酮以1：5～1:1的重量g体积ml比进行脱脂处理，重复脱脂至上层液体澄清。如上所述的制备方法，优选地，在步骤S4中，所述离心的条件为8000～12000g，离心温度2～8℃，时间为15～20min；所述过滤及除菌过滤为先用4000目滤布过滤后，再通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤。如上所述的制备方法，优选地，在步骤S5中，所述超滤浓缩用3KD超滤膜超滤，当超滤透过液总蛋白含量≤0.02mg/ml，停止超滤；当超滤透过液总蛋白含量>0.02mg/ml，更换超滤膜之后对超滤透过液重复超滤，直至超滤透过液总蛋白含量≤0.02mg/ml为止。如上所述的制备方法，优选地，在步骤S6中，所述真空冻干的条件为-50～-35℃冻结，2～8mbar真空压力下，-25℃干燥，控制水分含量≤3％。如上所述的制备方法，优选地，所述步骤S1还包括对原料地肤花粉进行镜检鉴别和/或DNA鉴定的步骤，其中DNA鉴定方法为，以SEQIDNO.1、SEQIDNO.2为引物，对鉴别地肤花粉原料进行PCR扩增，并检测扩增产物。如上所述的制备方法，优选地，所述磷酸盐—盐水缓冲液的终浓度包括4.5～5.5g/L的氯化钠、0.03％～0.05％的磷酸二氢钾、1.5％～2％十二水合磷酸氢二钠和0.2％～0.4％的苯酚。在制备地肤花粉变应原进行浸提时，专利技术人尝试了多种浸提液，并且比较了它们的浸提效率。所使用的浸提液包括：0.8％的氯化钠、pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、pH8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、pH8.2的coca’s液、pH8.9的Tris-盐酸缓冲液、pH为7.9～8.2的含有4.5～5.5g/L的氯化钠及重量百分比含量为0.03％～0.05％的磷酸二氢钾，1.5％～2％十二水合磷酸氢二钠，0.2％～0.4％的苯酚等。实验结果证实，使用pH为7.9～8.2的含有4.5～5.5g/L的氯化钠及0.03％～0.05％的磷酸二氢钾，1.5％～2％十二水合磷酸氢二钠，0.2％～0.4％的苯酚的浸提效率较高，且制备的地肤花粉变应原浸液可长期有效的保存，稳定性高。本专利技术还提供一种地肤花粉变应原冻干品本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种地肤花粉变应原浸物，其含有致敏蛋白Koc S1’；所述Koc S1’含有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种地肤花粉变应原浸物，其含有致敏蛋白KocS1’；所述KocS1’含有如SEQIDNO.4所示的氨基酸序列。2.一种地肤花粉变应原浸液，其特征在于，所述变应原浸液中含有治疗有效量或诊断有效量的地肤花粉变应原、体积比为0.2～0.4％的苯酚、体积比为45～55％的甘油和4.5～5.5g/L的NaCl，其pH值为6.0～8.0。3.根据权利要求2所述的地肤花粉变应原浸液，其特征在于，所述地肤花粉变应原的活性浓度为50000～200000BAU/ml。4.根据权利要求2所述的地肤花粉变应原浸液，其特征在于，所述地肤花粉变应原浸液的总蛋白浓度0.28～1.12mg/ml。5.根据权利要求2所述的地肤花粉变应原浸液，其特征在于，通过SDS-PAGE和WesternBlotting检测，所述地肤花粉变应原的蛋白分布主要在11kDa、14.5kDa、18kDa、28kDa、42kDa、68kDa、72kDa、85kDa和115kDa。6.根据权利要求2所述的地肤花粉变应原浸液，其特征在于，通过全蛋白质谱或经SDS-PAGE分离后将对应分子量胶条分别取样进行质谱检测，所述地肤花粉变应原浸提物主要含且不限于如SEQIDNO.6-SEQIDNO.17所示的特征性肽段。7.一种根据权利要求2-6中任一项所述地肤花粉变应原浸液的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：S1、采集地肤花粉，常温干燥真空干燥或流化床干燥；S2、对干燥后的花粉脱脂、干燥；S3、将脱脂干燥后的地肤花粉按重量g体积ml比1:50～1:10加入pH为7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2-8℃搅拌22～26h进行浸提；S4、取步骤S3后的浸提液，离心取上清液；将上清液过滤及除菌过滤；S5、将过滤后的上清液进行超滤浓缩，获得超滤浓缩液；S6、将所述超滤浓缩液经过二次过滤和除菌过滤后，真空冻干获得地肤花粉变应原冻干品；S7、将所述地肤花粉变应原冻干品用pH6.5～7.5磷酸盐—盐水缓冲液复溶配置为地肤花粉变应原原液，2～8℃放置，与等体积灭菌的甘油混匀，调节溶液pH值至6.0～8.0。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述花粉脱脂采用花粉与丙酮以1：5～1:1的重量g体积ml比进行脱脂处理，重复脱脂至上层液体澄清。9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，所述离心的条件为8000～12000g，离心温度2～8℃，时间为15～20min；所述过滤及除菌过滤为先用4000目滤布过滤后，再通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤。10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述超滤浓缩用3KD超滤膜超滤，当超滤透过液总蛋白含量≤0.02mg/ml，停止超滤；当超滤透...
【专利技术属性】
技术研发人员：周俊雄，尹佳，王良录，王瑞琦，顾建青，支玉香，李宏，汤蕊，
申请(专利权)人：中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：北京,11
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