一种高效扩增活化Vγ2Vδ2 T细胞增强其抗结核活性的方法技术

本发明专利技术涉及一种高效扩增活化Vγ2Vδ2 T细胞增强其抗结核活性的方法。所述方法为：抽取健康人的外周血，分离淋巴细胞，在无血清培养基中用唑来膦酸和白细胞介素2，白细胞介素15联合刺激，分别在刺激的第2、3、5天去除50％培养基，补充含有细胞因子的新鲜培养基。在培养3‑15天后，加入白细胞介素12和细胞介素18联合刺激12‑72小时，能够有效扩增并增强Vγ2Vδ2 T细胞对胞内感染分枝杆菌的抑制或杀灭效果。该类细胞可以用于临床结核病及相关感染性疾病以及肿瘤的细胞免疫治疗。

An efficient method for amplification and activation of V gamma 2V Delta 2T cells to enhance their anti-tuberculosis activity

【技术实现步骤摘要】
一种高效扩增活化Vγ2Vδ2T细胞增强其抗结核活性的方法
本专利技术涉及生物医药
，具体地说，涉及一种高效扩增活化Vγ2Vδ2T细胞增强其抗结核活性的方法。
技术介绍
结核病tuberculosis(TB)是由结核分枝杆菌及其复合菌群感染引起的传染病。由于结核病的现有唯一预防性疫苗BCG的保护效果不理想，HIV与TB的共感染，以及耐多药结核病的出现等问题，使得目前结核病的防治依然面临严峻的挑战。耐多药结核病是指结核病人体内的病原菌对多种临床使用的抗结核药物产生了耐药性。目前，耐多药结核病是结核病治疗过程中面临最大的问题。现在所有的临床抗结核化学药物都发现了耐药菌株，耐多药结核病面临无药可用的地步。目前尚无新型抗结核化学药物问世，因此需要开发新型的治疗方法来治疗结核病。结核分枝杆菌是胞内寄生菌，细胞免疫在抵抗结核菌感染过程中发挥重要作用。结核病的细胞免疫治疗可以诱发宿主特异性免疫应答，来杀死细胞内寄生的结核分枝杆菌。免疫治疗和化学药物的联合使用为结核病的治疗提供了新思路，尤其为耐药结核病的治疗开辟了新途径。Vγ2Vδ2T细胞又名Vγ9Vδ2T细胞，占人体外周血细胞约1-10％、γδT细胞的90％左右，在人体先天性免疫和后天免疫中发挥重要作用。我们前期的大量研究证明，Vγ2Vδ2T细胞具有临床用于结核免疫治疗的潜力。Vγ2Vδ2T细胞是唯一能够识别结核磷酸抗原的γδT细胞，只存在于人和非人灵长类，其它动物不存在这种抗原特异的γδT细胞。我们建立了体内靶向扩增Vγ2Vδ2T细胞的方法，并证明Vγ2Vδ2T细胞靶向免疫治疗对猴结核病有显著的治疗效果。但目前未见体外高效扩增活化Vγ2Vδ2T细胞用于TB治疗的报道。期刊《郑州大学学报：医学版》2011年第4期刊出的文章“中国猕猴CD4+CD25+调节性T细胞对Vγ2Vδ2T细胞体外增殖的影响”，公开了IL-2联合HMBPP可体外预激活Vγ2Vδ2T细胞。专利文献CN103555666A，公开日2014.02.05，公开了一种提高Vγ9Vδ2T细胞扩增效率及活性的培养方法，应用IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼体外诱导Vγ9Vδ2T细胞的生成，得到了诱导效率更高及活性更高的Vγ9Vδ2T细胞。但仍需要更高效的Vγ2Vδ2T细胞扩增活化方法，尤其是提高Vγ2Vδ2T细胞抗结核效应功能的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种高效扩增活化Vγ2Vδ2T细胞，提高Vγ2Vδ2T细胞抗结核效应功能的方法。第一方面，本专利技术提供了高效扩增活化Vγ2Vδ2T细胞的方法，包括以下步骤：将新鲜分离的外周淋巴细胞使用含0.75-15μg/ml唑来膦酸、5-100ng/mlIL-2、10-200ng/mlIL-15的培养体系进行培养，其中，分别在刺激的第2、3、5天去除50％培养基，补充含有相同浓度细胞因子的新鲜培养基。作为一个优选例，在使用所述培养体系培养3-15天后，向培养体系中加入50-200ng/mlIL-12和50-200ng/mlIL-18，继续培养12-72小时。作为另一优选例，所述培养体系使用的培养基为X-VIVO15免疫细胞无血清培养基或含10％胎牛血清的1640培养基。作为另一优选例，培养后，还包括对Vγ2Vδ2T细胞分离的步骤。作为另一优选例，所述外周淋巴细胞是采用Ficoll分离方法获得的。第二方面，本专利技术提供了如上任一所述方法获得的Vγ2Vδ2T细胞。第三方面，本专利技术提供了如上所述的Vγ2Vδ2T细胞在制备细胞免疫药物或疫苗中的应用。作为一个优选例，所述细胞免疫药物用于治疗感染性疾病或肿瘤。更优选地，所述感染性疾病为结核病。更优选地，所述肿瘤选自消化系统肿瘤如食道癌，胃癌，结直肠癌，肝癌，胰腺癌，胆管及胆囊癌；呼吸系统肿瘤如肺癌，胸膜瘤；血液系统肿瘤如白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤；妇科及生殖系统肿瘤如乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，外阴癌，睾丸癌，前列腺癌，阴茎癌；神经系统肿瘤如胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤；头颈部肿瘤如口腔癌，舌癌，喉癌，鼻咽癌；泌尿系统肿瘤如肾癌，膀胱癌，皮肤及其他系统如皮肤癌、黑色素瘤、骨肉瘤，脂肪肉瘤，甲状腺癌。本专利技术优点在于：1、本专利技术方法其Vγ2Vδ2T细胞体外扩增效率高；2、根据本专利技术方法获得的Vγ2Vδ2T细胞具有显著的抗结核效应功能；3、根据本专利技术方法获得的Vγ2Vδ2T细胞可用于人体进行细胞免疫治疗，包括针对结核病及其它胞内菌感染的感染性疾病以及肿瘤的细胞免疫治疗。附图说明图1.IL-2和IL-15联合使用能够诱导更高比例的Vγ2Vδ2T细胞。PBMC细胞采用不同的处理培养7天，各组处理条件如下：A.Medium，即培养基；B.ZOL，即采用唑来膦酸刺激；C.ZOL+IL-2，即采用唑来膦酸和IL-2共同刺激；D.ZOL+IL-2+IL-15，即采用唑来膦酸和IL-2+IL-15两种细胞因子共同刺激；E.ZOL+IL-15，即采用唑来膦酸和IL-15共同刺激。采用抗体进行表面染色后，进行流式分析，横坐标为Vγ2-FITC，纵坐标为Vδ2-APC。图2.扩增后的Vγ2Vδ2T细胞能够显著抑制巨噬细胞内感染的BCG的生长。实验处理：M组是只有培养基Medium；ZOL组是只加唑来膦酸处理组；ZOL+IL-2+IL-15是唑来膦酸和IL-2以及IL-15共同处理组；ZOL+IL-2是唑来膦酸和IL-2处理组；ZOL+IL-15是唑来膦酸和IL-15处理组。图3.用IL-12+IL-18进行48小时刺激能够进一步增强Vγ2Vδ2T细胞的杀菌功能。各组实验处理：Medium是指培养基处理组；ZOL+IL-2组是唑来膦酸和IL-2处理组；ZOL+IL-2+IL-15+IL-12+IL-18是唑来膦酸和IL-2，IL-15，IL-12，IL-18共同处理组；ZOL+IL-2+IL-15(+IL-12+IL-18)是唑来膦酸和IL-2+IL-15处理5天后，再采用IL-12+IL-18刺激48小时。图4.不同浓度的ZOL对Vγ2Vδ2T细胞亚群刺激诱导效果的比较。PBMC刺激后，采用特异抗体进行染色进行流式分析，同时统计了相应细胞亚群的细胞数目。具体实施方式下面结合附图对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。实施例1一、实验材料X-VIVO15培养基：购于LONZA公司，商品号04-418Q；IL-2：购于R&DSystems公司，商品号202-IL-500；IL-15：购于R&DSystems公司，商品号247-ILB-025；IL-12：购于BIOLEGEND公司，商品号573002；IL-18：购于BIOLEGEND公司，商品号592104。二、实验方法1.外周淋巴细胞分离及刺激条件采集实验人群外周血，用抗凝管收集。采用Ficoll分离方法，来分离外周淋巴细胞(PBMC)。细胞按照0.5million(百万单位)/孔的密度，在U型底的96孔板中进行培养，每孔加200μl培养基。培养基为可以用于临床细胞治疗用细胞培养的X-VIVO15培养基，该培养基不含血清，培养过程中，也不再添加血清。新鲜分离的PBMC细胞培养体系中，根据不同需要分别加入下列刺激物。唑来膦酸(zoledronic本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效扩增活化Vγ2Vδ2T细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将新鲜分离的外周淋巴细胞使用含0.75‑15μg/ml唑来膦酸、5‑100ng/ml IL‑2、10‑200ng/ml IL‑15的培养体系进行培养，其中，分别在刺激的第2、3、5天去除50％培养基，补充含有相同浓度细胞因子的新鲜培养基。

【技术特征摘要】
1.一种高效扩增活化Vγ2Vδ2T细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将新鲜分离的外周淋巴细胞使用含0.75-15μg/ml唑来膦酸、5-100ng/mlIL-2、10-200ng/mlIL-15的培养体系进行培养，其中，分别在刺激的第2、3、5天去除50％培养基，补充含有相同浓度细胞因子的新鲜培养基。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用所述培养体系培养3-15天后，向培养体系中加入50-200ng/mlIL-12和50-200ng/mlIL-18，继续培养12-72小时。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养体系使用的培养基为X-VIVO15免疫细胞无血清培养基或含10％胎牛血清的1640培养基。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，培养后，还包括对Vγ2Vδ2T细胞分离...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈洪波，陈维政，沙巍，
申请(专利权)人：上海市肺科医院，
类型：发明
国别省市：上海,31