一种诱导造血干细胞向前T系细胞分化的方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种诱导造血干细胞向前T系细胞分化的方法和试剂盒，属于生物医学技术领域。本发明专利技术将成纤维细胞过表达DLL4蛋白后与造血干细胞共培养，诱导造血干细胞向前T系细胞分化发育；或采用过表达DLL4蛋白的细胞与造血干细胞共培养，诱导纤维化疾病中的造血干细胞向前T系细胞分化发育。本发明专利技术诱导获得的T细胞处于胸腺发育DN2或DN3两个重要阶段。诱导的异体DN2或DN3阶段T细胞具有定植胸腺并发育成为功能完全的成熟T细胞，同时细胞数量也在异体胸腺内得到有效大量扩增，并通过异体胸腺内的发育成为具有对受体耐受的T细胞，因此成为通用型Car‑T细胞来源的基础。

A Method and Kit for Inducing Differentiation of Hematopoietic Stem Cells into Forward T-Line Cells

【技术实现步骤摘要】
一种诱导造血干细胞向前T系细胞分化的方法和试剂盒
本专利技术涉及一种诱导造血干细胞向前T系细胞分化的方法和试剂盒，属于生物医学

技术介绍
机体免疫系统，特别是T细胞群的重建，是治疗艾滋病、肿瘤、衰老的重大临床问题之一。当前HIV-1感染所致的获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunedeficiencysyndrome,AIDS)是一个重大的公共健康威胁，艾滋病往往伴随着免疫功能下降或受到抑制，进而导致一系列临床症状。在完全抑制HIV病毒繁殖和清除病毒后，CD4+T细胞数量和功能逐渐恢复与重建，一直是艾滋病治疗的终极目标。目前抗逆转录病毒治疗(anti-retroviraltherapy,ART)能改善患者的生活质量并延长寿命，降低了机会性感染率和早期死亡率，这种效果与病毒引起的免疫退化终止，以及其在一定程度上免疫功能的重建有关。但是该法治疗后短期内，机体免疫重建并不快，外周血CD4+T淋巴细胞数增加有限。此外，临床上约有16％患者在ART长期治疗后，病毒得到抑制的情况下仍不能取得良好的免疫重建，导致发生免疫重建不良现象。另一方面，感染艾滋病毒患者随着免疫功能下降，往往合并感染乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)，以及ART治疗过程中药物产生的肝毒性，所以常会导致病人严重的肝硬化和肝功能的丧失。因此，也很有必要寻找有效的治疗策略以满足这些艾滋病合并肝炎病毒感染患者的治疗。众所周知，胸腺是T淋巴细胞发育和分化的主要场所。本质上，它可被视为一个由高度特化的胸腺上皮细胞构成的三维网络，其间充满着不同发育阶段T细胞。在上皮细胞所提供的各种信号的支持下，从骨髓迁入胸腺的造血祖细胞展开既定的发育程序，经历增殖、定向分化、TCR重排、β选择、阳性选择和阴性选择等复杂发育过程，最终形成一个具有高度多样性，并能有效区分“自我”与“非我”的T细胞库。T细胞在胸腺内的发育是一个高度有序的、多阶段、极为复杂的过程，不同的发育阶段有赖于胸腺微环境所提供的各异的信号。附图1是细胞胸腺发育的流程示意图，淋巴前体细胞(Commonlymphoidprogenitor,CLP)由骨髓迁入胸腺，遵从一定的发育程序向成熟T细胞分化。根据CD4和CD8表达如否，胸腺T细胞发育分为三个主要阶段，即双阴性(DoubleNegative,DN)、双阳性(DoublePositve,DP)和单阳性(SinglePositive,SP)阶段。基于CD117、CD44及CD25表达情况，DN细胞又分作DN1～DN4四群，分别代表不同发育阶段。不同的体外研究体系已用来模拟淋巴细胞分化发育，OP9体系最为成熟。OP9细胞是取自新生osteopetrotic(op9/op9)小鼠骨髓的基质细胞。该细胞株存在细胞因子M-CSF(Macrophagecolony-stimulatingfactor)的基因缺陷。M-CSF有支持髓系(myeloid)分化的作用，即向CMP(Commonmyeloidprogenitor)细胞方向分化发育，因此缺乏M-CSF表达的OP9细胞可通过限制造血干细胞髓系发育转而向CLP(Commonlymphoidprogenitor)即淋巴前体细胞方向分化发育，来达到支持B细胞等淋系细胞发育的目的，但不能支持T细胞的体外分化。2002年，Schmitt和-Pflücker用Notch配体分子DLL1(Delta-likeligand1)的逆转录病毒表达载体转染OP9细胞，建立了稳定表达DLL1分子的OP9-DL1细胞；DLL1分子在OP9基质细胞表面的过表达提供了T细胞定向分化所需的Notch信号，从而使该基质细胞失去了支持B细胞分化的能力，反而可高效诱导T淋巴细胞的体外生成。随后的研究也表明OP9-DL4(过表达DLL4)也能够发挥同样的作用。OP9-DL1细胞可使与其共培养的造血干细胞产生大量T前体细胞(约扩增1000～4000倍)，并按正常的发育程序分化为功能完全成熟的T淋巴细胞(包括αβTCR+和γδTCR+T细胞)。而OP9-DL1作为一种贴壁生长的基质细胞则十分易于培养和扩增，用于T细胞的体外诱导更为方便和有效。另外，采用流式分选该共培养体系中的CD45+CD44+CD25+的DN2(DoubleNegativestage2)细胞，采用尾静脉注射入Rag2敲除小鼠后，可在Rag2敲除小鼠外周血中检测到CD4+T和CD8+T的存在，表明共培养获得的DN2细胞具有定植胸腺并进而发育成为成熟T细胞的能力，同时也表明该体外培养体系具有用于体内T细胞重建的潜力。OP9-DL1诱导模型的建立不仅粉碎了长期控制免疫学领域的一种观点即：从淋巴祖细胞发育成为T细胞的过程需要完整的胸腺，T细胞不可能在单层基质细胞的支持下从造血干细胞分化而来；并且使在非胸腺环境下的T细胞体外大规模诱生成为现实。虽然OP9-DL1基质细胞诱导T细胞培养体系已被越来越多的实验室采纳和使用。但是我们也要看到，该体外诱导系统尚存在一些理论上和实际应用方面的问题。首先，OP9细胞不表达MHC分子和CD1d分子，无法实现发育过程中T细胞或NKT细胞的阳性选择和阴性选择；另外，OP9是鼠源的骨髓基质细胞，因此尚需对其诱导产生的人源T淋巴细胞的确切性质做进一步的研究，如：T细胞表面TCR分子的表达谱型、T细胞的体内外功能等。因此也有必要寻找与OP9类似能产生相同作用的细胞类型。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种体外诱导小鼠或人造血干细胞向胸腺T系细胞分化的方法，原代肝成纤维细胞能够通过某种机制，限定造血干细胞向T/B淋巴细胞系分化，并在过表达DLL4后能够促进T细胞的分化和发育，采用肝脏来源的原代成纤维细胞，过表达DLL4后与造血干细胞共培养，能够促进T细胞的分化和发育。人原代肝脏成纤维细胞在过表达DLL4后也具有同样的促进作用，能够促进人脐带来源的造血干细胞向DN2-DN3细胞分化。本专利技术的第一个目的是提供一种DLL4在制备诱导造血干细胞向前T细胞系分化药物中的应用。进一步地，所述的应用具体为将成纤维细胞过表达DLL4蛋白后与造血干细胞共培养，获得诱导造血干细胞向前T系细胞分化的药物。进一步地，所述的应用具体为将过表达DLL4蛋白的细胞与造血干细胞共培养，获得诱导纤维化疾病中造血干细胞向前T系细胞分化的药物。进一步地，所述的成纤维细胞为原代肝成纤维细胞。进一步地，所述的过表达DLL4蛋白的细胞为过表达DLL4蛋白的间充质干细胞、过表达DLL4蛋白的胸腺上皮基质细胞、过表达DLL4蛋白的成纤维细胞中的一种或一种以上组合。进一步地，所述的造血干细胞是将脐带血细胞红细胞裂解后，用谱系细胞耗竭试剂盒阴选后，采用流式分选人造血干细胞。进一步地，所述的前T系细胞为DN2细胞和/或DN3细胞。进一步地，所述的药物为注射剂。进一步地，所述的药物中还包括诱导分化的试剂。进一步地，包括成纤维细胞和造血干细胞共培养的试剂。进一步地，所述的共培养在体外培养时，具体包括如下步骤：(1)配制含15％FBS的MEMα培养基，并添加终浓度为25-50ng/mL的SCF、5-10ng/mL的Flt3L、1-20ng/mL的IL-7，分装后于-20℃保存；(2)培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DLL4在制备诱导造血干细胞向前T细胞系分化药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.一种DLL4在制备诱导造血干细胞向前T细胞系分化药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用具体为将成纤维细胞过表达DLL4蛋白后与造血干细胞共培养，获得诱导造血干细胞向前T系细胞分化的药物。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用具体为将过表达DLL4蛋白的细胞与造血干细胞共培养，获得诱导纤维化疾病中造血干细胞向前T系细胞分化的药物。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的成纤维细胞为原代肝成纤维细胞。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的过表达DLL4蛋白的细胞为过表达DLL4蛋白的间充质干细胞、过表达DLL4蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：时玉舫，龚拯，陈永井，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32