一种人胎盘亚全能干细胞的分离方法技术

本发明专利技术公开了一种人胎盘亚全能干细胞的分离方法，包括S1.羊膜样品制备；S2.羊膜试样制备；S3.酶解；本方案流程短，工序简单，而且在羊膜试样制备步骤中，采用分区剥离羊膜的方式，羊膜不易碎，一方面规则的羊膜便于后续的冲洗、去凝血和胶状物、一次酶解和二次酶解作业，另一方面分区剥离羊膜的方式能够确保羊膜取干净，保证了人胎盘亚全能干细胞的收得率。本方案分区剥离的羊膜规则整齐，便于清理，羊膜上的凝血和胶状物清理干净，保证了酶解效果；而且清理后的羊膜试样采用两次酶解，第一次酶解去除羊膜上的杂细胞，因此无需再使用Ficoll淋巴细胞分离液分离，也能得到纯度较高的人胎盘亚全能干细胞。

Isolation of Human Placental Subtotipotent Stem Cells

【技术实现步骤摘要】
一种人胎盘亚全能干细胞的分离方法
：本专利技术涉及一种人胎盘亚全能干细胞的分离方法，属于生物医药

技术介绍
：胎盘是一个暂时性的器官，是母体和胎儿的直接联系枢纽，在整个妊娠期内对胎儿的发育和生长相当重要，有重要的生理作用，可在胎儿和母体之间进行养分、气体和代谢废物的交换；不仅如此，胎盘在妊娠期间还参与了胎儿的免疫保护，因此胎盘是一个具有多功能的器官。有研究表明：宝宝出生后胎盘中还保留有丰富的生命资源，可以分离出大量胎盘亚全能干细胞，其发育阶段与胚胎干细胞接近，具备全能干细胞的生物学特征，数量丰富，分化能力强，可定向分化为血管内皮细胞、上皮干细胞、神经干细胞、肝脏细胞、心肌细胞、脂肪细胞、骨、软骨样细胞等。因此亚全能干细胞具有重要的临床意义，成为研究的热点，但是，如何从胎盘中成功高效地分离获得胎盘亚全能干细胞是干细胞研究中的难点。现有胎盘亚全能干细胞分离方法包括羊膜预处理-酶解消化-两步离心步骤；其中羊膜预处理是从胎盘剥离羊膜(局部将羊膜用镊子提起，然后用剪刀剪下)，并用pH＝7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液冲洗至无残留血液后，剪碎得到5×5cm2羊膜块；而后将羊膜块上皮层向下，放入D-Hank’s平衡盐液润湿底部的培养皿中，使用载玻片将间充质层的胶状物质刮下，最后将去胶的羊膜块放入10mL含10％(w/v)N-乙酰基-L-半胱氨酸的D-Hank’s平衡盐溶液，室温孵育15min，去除羊膜上的黏液，得到羊膜样块；酶解消化步骤是将羊膜样块置于20mL蛋白酶溶液中，在37℃下气浴消化30min，得到消化后羊膜和消化液；所述消化液过滤，得到细胞悬液；两步离心步骤是将细胞悬液过筛并收集筛下物，经初步离心后，将底层细胞用D-Hank’s平衡盐溶液吹打；而后用D-Hank’s平衡盐溶液重悬细胞，向重悬后的细胞悬液加入Ficoll淋巴细胞分离液，再次经离心分离后，细胞悬液分为三层，中层为人胎盘亚全能干细胞。现有胎盘亚全能干细胞分离方法中，局部将羊膜用镊子提起，然后用剪刀剪下，均为不规则的碎块，而且羊膜极薄，很容易剥碎，一方面无法确保羊膜完全取尽，导致人胎盘亚全能干细胞的得率较低；另一方面，现有胎盘亚全能干细胞分离方法中，羊膜用镊子剥离得到的碎块不规则，不便于使用细胞刮刮去凝血和胶状物，影响了酶解效果，最终得到的人胎盘亚全能干细胞中杂细胞较多，为得到纯度更高的人胎盘亚全能干细胞，需要在重悬时加入Ficoll淋巴细胞分离液，比重较大的杂细胞(如红细胞)离心后沉于管底，比重较小的杂细胞(如单核细胞)漂浮于分层液的液面上，人胎盘亚全能干细胞夹于两层液面之间，由于传统方法得到的人胎盘亚全能干细胞量少，取出操作费时费力；而且从两层液面之间取出人胎盘亚全能干细胞时，极易取不干净或连同其他杂细胞一同取出，影响细胞得率和纯度。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一种能够减少分离时间，并得到得率和纯度较高的人胎盘亚全能干细胞的分离方法。本专利技术由如下技术方案实施：一种人胎盘亚全能干细胞的分离方法，包括如下步骤：S1.羊膜样品制备；S2.羊膜试样制备；S3.酶解；其中：所述S1.羊膜样品制备：将待取羊膜的胎盘盘面分为规则的区域，而后揭起羊膜并按照分好的区域裁剪，得到规则的羊膜样品；所述S2.羊膜试样制备：将所述羊膜样品用pH＝7.2-7.4的磷酸盐缓冲液冲洗，并用镊子和细胞刮处理羊膜样品上的凝血和胶状物，待羊膜样品呈半透明状，以防影响后续酶的消化效率，得到羊膜试样；所述S3.酶解，将羊膜试样酶解，制得人胎盘亚全能干细胞。羊膜位于胎盘的最内层，主要由来源于外胚层的上皮细胞和来源于中胚层的间充质细胞构成，其不含血管，细胞成分相对简单，在胎儿娩出后即成为废弃物；胎盘上的凝血是粘附在羊膜上的黑红色块状物，胶状物附着在羊膜表面，呈透明状，用镊子取大块的凝血，然后用细胞刮轻柔缓慢刮下羊膜上剩余的凝血和明胶，观察羊膜呈半透明状，即为羊膜已处理干净。由于凝血及凝血表面含有血清，而血清能够抑制胰蛋白酶的活性，所以处理后的羊膜可以提高胰蛋白酶对羊膜细胞的消化效率，获得更多的羊膜上皮细胞。进一步的，所述S1.羊膜样品制备中，羊膜样品形状为环形、多边形中的任意一种。进一步的，所述S1.羊膜样品制备：将胎盘有脐带连接口的一面朝上放置，以脐带与胎盘连接处为起点，以顶点与胎盘边缘的连线为轴线圆周分区，将羊膜取下，得到环状的羊膜样品。进一步的，环状的所述羊膜样品的宽度为3-5cm。进一步的，所述S1.羊膜样品制备：将胎盘有脐带连接口的一面朝上放置，以脐带与胎盘连接处为起点，以顶点与胎盘边缘的连线为裁剪起点，进行多边形或扇形分区。进一步的，所述S3.酶解包括如下步骤：S3.1.一次酶解：将S2.羊膜试样制备中得到的羊膜试样放入预处理后的0.1(w/v)％胰蛋白酶溶液中，确保羊膜试样充分展平、无折叠，胰蛋白酶溶液可以采用市售胰蛋白酶粉兑水制得，羊膜试样表面积与胰蛋白酶溶液体积比(s/v)＝10cm2：(0.8-1.5)ml；在37℃下酶解10-15min，为了清除一次酶解产物粘附于羊膜试样表面，将一次酶解后的羊膜试样用磷酸盐缓冲液清洗，以便保证羊膜表面的清洁，得到一次酶解试样；一次酶解的目的是去除羊膜上的残留杂细胞；S3.2.二次酶解：将S3.1.一次酶解得到的一次酶解试样放入预处理后的0.1(w/v)％胰蛋白酶溶液中，确保一次酶解试样充分展平、无折叠，一次酶解试样表面积与胰蛋白酶溶液体积比(s/v)＝10cm2：(0.8-1.5)ml；在37℃下酶解45-60min，分离得到二次酶解液和二次酶解试样，而后在二次酶解液中加入胎牛血清终止酶解；S3.3.得到人胎盘亚全能干细胞：S3.2.二次酶解得到的加入胎牛血清的二次酶解液经100目的细胞筛过滤，收集细胞初悬液，送入离心机内离心，弃掉上清液，而后加入DMEM细胞培养液重悬细胞，得到人胎盘亚全能干细胞悬液，人胎盘亚全能干细胞需接种到培养瓶中，37℃培养箱内培养。进一步的，由于酶解下来的人胎盘亚全能干细胞会粘附或被包裹在二次酶解试样里，为收集更多的人胎盘亚全能干细胞，所述S3.2.二次酶解得到的二次酶解试样用磷酸盐缓冲液冲洗，得到的冲洗液加入二次酶解液中。进一步的，所述胰蛋白酶溶液的预处理方法是将4℃保存的胰蛋白酶溶液放入37℃培养箱中预热，直到胰蛋白酶溶液达到37℃。进一步的，所述S3.3.得到人胎盘亚全能干细胞中，所述细胞初悬液的离心速度为1500r/min。进一步的，所述S3.3.得到人胎盘亚全能干细胞中，所述细胞初悬液的离心时间10min。进一步的，所述S3.3.得到人胎盘亚全能干细胞中，所述DMEM细胞培养液的加入量为10mL。本专利技术的优点：1、本方案包括羊膜样品制备-羊膜试样制备-一次酶解-二次酶解-得到人胎盘亚全能干细胞，减少了工序，流程短，工序简单，而且在羊膜试样制备步骤中，采用分区剥离羊膜的方式，羊膜不易碎，一方面规则的羊膜样品便于后续的冲洗、细胞刮去凝血和胶状物、一次酶解和二次酶解作业，另一方面分区剥离羊膜的方式能够确保羊膜取尽，保证了人胎盘亚全能干细胞的得率。2、本方案分区剥离的羊膜样品规则整齐，便于清理，羊膜上的凝血和胶状物清理干净，保证了酶解效果；而且清理后的羊膜试样采用两次酶解本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人胎盘亚全能干细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.羊膜样品制备；S2.羊膜试样制备；S3.酶解；其中：所述S1.羊膜样品制备：将待取羊膜的胎盘盘面分为规则的区域，而后揭起羊膜并按照分好的区域裁剪，得到规则的羊膜样品；所述S2.羊膜试样制备：将所述羊膜样品用pH＝7.2‑7.4的磷酸盐缓冲液冲洗，并用镊子和细胞刮处理羊膜样品上的凝血和胶状物，待羊膜样品呈半透明状，得到羊膜试样；所述S3.酶解，将羊膜试样酶解，制得人胎盘亚全能干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种人胎盘亚全能干细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.羊膜样品制备；S2.羊膜试样制备；S3.酶解；其中：所述S1.羊膜样品制备：将待取羊膜的胎盘盘面分为规则的区域，而后揭起羊膜并按照分好的区域裁剪，得到规则的羊膜样品；所述S2.羊膜试样制备：将所述羊膜样品用pH＝7.2-7.4的磷酸盐缓冲液冲洗，并用镊子和细胞刮处理羊膜样品上的凝血和胶状物，待羊膜样品呈半透明状，得到羊膜试样；所述S3.酶解，将羊膜试样酶解，制得人胎盘亚全能干细胞。2.根据权利要求1所述一种人胎盘亚全能干细胞的分离方法，其特征在于，所述S1.羊膜样品制备中，羊膜样品形状为环形、多边形或扇形中的任意一种。3.根据权利要求1所述一种人胎盘亚全能干细胞的分离方法，其特征在于，所述S1.羊膜样品制备：将胎盘有脐带连接口的一面朝上放置，以脐带与胎盘连接处为起点，以顶点与胎盘边缘的连线为轴线圆周分区，将羊膜取下，得到环状的羊膜样品。4.根据权利要求3所述一种人胎盘亚全能干细胞的分离方法，其特征在于，环状的所述羊膜样品的宽度为3-5cm。5.根据权利要求1所述一种人胎盘亚全能干细胞的分离方法，其特征在于，所述S1.羊膜样品制备：将胎盘有脐带连接口的一面朝上放置，以脐带与胎盘连接处为起点，以顶点与胎盘边缘的连线为裁剪起点，进行多边形或扇形分区。6.根据权利要求1-5任一所述一种人胎盘亚全能干细胞的分离方法，其特征在于，所述S3.酶解包括如下步骤：S3.1.一次酶解：将S2.羊膜试样制备中得到的羊膜试样放入预处理后的0.1(w/v)％胰蛋白酶溶液中，确保羊膜试样充分展平、无折叠，羊膜试样表面积与胰蛋白酶溶液体积比(s/v)＝10cm2：(0.8-...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋丽霞，胡燕，张潇，李彬，刘伟，
申请(专利权)人：内蒙古银宏干细胞生命科技投资有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15