抗α-突触核蛋白的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及抗体药物技术领域，具体涉及抗α‑突触核蛋白的单克隆抗体及其应用。本发明专利技术提供的抗α‑突触核蛋白的单克隆抗体能够特异性结合α‑突触核蛋白的单体和聚合体，对于人α‑突触核蛋白的单体和聚合体均具有较高的亲和力，对β‑突触核蛋白和γ‑突触核蛋白不具有结合力；能够有效抑制α‑突触核蛋白的单体的聚合，并且促进小胶质细胞对已形成的α‑突触核蛋白聚合体的清除，保护神经元细胞免受α‑突触核蛋白聚合体的毒性，可用于预防、治疗和诊断α‑突触核蛋白相关的疾病和病症，如帕金森病、路易体痴呆，合并阿尔茨海默病和帕金森病、纯自主神经衰竭、多系统萎缩等。

Monoclonal antibodies against alpha-synuclein and their applications

【技术实现步骤摘要】
抗α-突触核蛋白的单克隆抗体及其应用
本专利技术涉及抗体药物
，具体涉及抗α-突触核蛋白的单克隆抗体及其应用。
技术介绍
1.α-突触核蛋白(α-synuclein)α-突触核蛋白(α-synuclein)是突触核蛋白家族的一员，该蛋白家族由一群分子量约为14KD的蛋白组成，除α-synuclein外，还包括β-synuclein和γ-synuclein。人α-synuclein由位于第四染色体的SNCA基因编码，含有140个氨基酸，分为三个结构域，分别为N端的KTKEGV重复区(1-60aa)，中间的NAC区(61-95aa)和C端的脯氨酸富集区(96-140aa)。α-synuclein在脑组织中广泛表达，约占脑细胞中胞质总蛋白的1％，尤其在新皮质、海马、黑质、丘脑和小脑中高表达，也在心脏、肌肉和其它组织中少量表达。α-synuclein主要位于成熟神经元细胞的突触前末端，它不参与突触的形成，而是维持或调节现有的突触。正常生理状态下，α-synuclein的功能包括结合脂肪酸，调节某些酶和转运体的生理功能，并在突触可塑性、神经递质释放和突触囊泡再循环方面起着重要作用。现有证据表明，α-synuclein在SNARE复合物形成过程中起着分子伴侣蛋白的作用。它同时通过N端和C端结构域结合质膜的磷脂和突触蛋白-2，参与神经元高尔基体的活动和囊泡运输。除此之外，在突触前区域，α-synuclein通过与脑泡和磷脂膜相互作用，影响多巴胺的储存，并且通过和囊泡膜的作用，调节多巴胺的释放。α-synuclein对于认知功能的正常发展也是必不可少的，实验表明，敲除α-synuclein表达基因的小鼠在空间学习和工作记忆方面受损。2.α-synuclein相关的疾病由突触核蛋白异常引起的疾病被称做突触核蛋白病，也叫做路易体病。目前，路易体疾病仍然是老年人群中运动障碍和认知恶化的常见原因。突触核蛋白病的特征是多巴胺系统退化，运动改变，认知障碍，并形成路易体(LBs)和/或路易神经突起。突触核蛋白病包括神经元的和神经退行性的疾病，如帕金森病(PD，包括特发性帕金森病)，路易体痴呆(DLB，也称为弥漫性路易体病，DLBD)，合并阿尔茨海默病和帕金森病，纯自主神经衰竭和多系统萎缩(MSA)。一些非运动性体征和症状被认为是发生突触核蛋白病的先兆。这些早期症状包括REM睡眠行为障碍(RBD)、嗅觉丧失和便秘。而在疾病(例如PD和DLB)进展的晚期，通常可以检测到可溶性α-synuclein寡聚体在PD和DLB病人脑脊液中的显著增高，以及由α-synuclein形成的不溶性纤维沉淀，即路易小体(LBs)。α-synuclein是路易小体和神经包涵体的主要组成部分，是导致帕金森病和路易体病发病的重要机制，α-synuclein基因突变可以导致罕见家族性帕金森病。在人类、小鼠和果蝇等不同物种的动物模型中，α-synuclein过表达导致的形态和神经改变也证实了α-synuclein在路易体病发生过程中的重要作用。α-synuclein的异常也和部分阿尔茨海默病(AD)的发病相关。α-synuclein和AD之间的联系首先是在AD病人脑内的斑块中发现“非淀粉样成分(NAC)”，该种成分后来被证实是α-synuclein的片段。α-synuclein在体外能够促进Aβ的聚集，但是在体内并没有提高淀粉样斑块的沉积。尽管α-synuclein在体内对斑块的形成没有影响，但是通过比较单表达人APP/Aβ或α-synuclein基因的转基因鼠和双转基因鼠发现，双转基因鼠表现出神经突触丢失、胆碱乙酰转移酶阳性神经元的减少，以及比单转基因鼠更严重的认知损害。这项研究也同时揭示了Aβ能够在体内和体外极大地促进α-synuclein的聚集。3.α-synuclein的病理学机制(1)α-synuclein的聚集α-synuclein通常以可溶性单体蛋白的形式存在，但在溶液中呈无序状态，缺乏稳定的三级结构。可溶性α-synuclein可以通过泛素-蛋白酶系统(UPS)途径和伴侣蛋白介导的自噬(CMA)进行降解。但在病理条件下，α-synuclein单体会有聚集的倾向，聚合成寡聚体，进而形成分子量较高的不溶性纤维体。这些高度磷酸化和泛素化的不溶性纤维体会影响线粒体代谢，降低巨噬细胞的自噬效率，并产生神经元毒性造成神经元细胞死亡。α-synuclein的聚积和折叠受多种因素的影响，包括磷酸化、线粒体和溶酶体功能障碍，氧化和氮化应激。除此之外，突触核蛋白酶对α-synucleinC端的切割也会导致单体α-synuclein形成寡聚体，并且和疾病的严重程度密切相关。(2)α-synuclein的清除路易体中α-synuclein的清除可以通过蛋白酶体进行。研究表明，泛素-蛋白酶系统(UPS)或蛋白酶体的功能缺失会导致PD患者体内α-synuclein的聚集，内含体的形成以及神经元的退变。同样，通过抑制蛋白酶体的功能或过表达α-synuclein，也会导致细胞死亡的增加。UPS降解的蛋白通常有着比较短的半衰期(<10小时)，而α-synuclein的半衰期一般在16个小时左右。但是，一些研究并没有在蛋白酶体抑制剂存在的条件下检测到α-synuclein的升高，这很有可能是因为α-synuclein被降解半衰期更长蛋白的溶酶体降解了。这种降解被称为伴侣蛋白介导的自噬(CMA),涉及到hsc70伴侣蛋白和溶酶体膜受体lamp2a。野生型的α-synuclein既可以被UPS也可以被CMA降解。但是对PD病人脑黑质的研究表明，不溶性α-synuclein和α-synuclein聚合物会结合蛋白酶体并抑制其功能。α-synuclein的突变和多巴胺氧化形式也损害导致自噬上调的CMA途径。而α-synuclein的功能性清除障碍以及由此导致的蛋白质质量控制系统损害，特别是自噬，已成为神经退行性变的显著致病机制。另外一些研究表明，伴侣蛋白介导的自噬，也叫作巨型自噬，在降解α-synuclein聚合体的过程中起着重要作用。基于这些研究，发现野生型α-synuclein可以被CMA系统清除，而聚合体的α-synuclein只能通过巨型自噬来进行清除。但是，也需要考虑到，自噬系统本身的干扰，如在退行性细胞应激环境中所见，也可能促进α-突触核素的毒性。4.治疗性抗α-synuclein抗体事实上，通常在介入治疗时，已经可以检测到聚合体的出现，而自身抗体在此时即使可以改善症状，也并不能完全清除聚合体，这也体现在大规模比较PD病人和正常人自身抗体时，并没有统计学上的差异。随着对α-synuclein清除机制的深入研究，针对于α-synuclein抗体介导的清除成为治疗α-synuclein病的突破点。在动物实验中，结合α-synucleinC端的抗体能够减少PD模型鼠脑中α-synuclein的聚集并缓解病理症状。而溶酶体抑制剂能够降低抗体的保护作用，表明自噬介导的清除机制参与了α-synuclein聚合体的降解。除此之外，能够有效的抑制α-synuclein的聚集也成为了治疗α-synuclein病的突破口之一。通过抗体来抑制α-synuclein的聚集，能够本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗α‑突触核蛋白的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其片段能够特异性地结合α‑突触核蛋白单体以及α‑突触核蛋白聚合体；所述单克隆抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR区序列如下：(1)CDR1：具有如SEQ ID NO.1‑3所示的任一序列或具有如SEQ ID NO.1‑3所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；(2)CDR2：具有如SEQ ID NO.4‑6所示的任一序列或具有如SEQ ID NO.4‑6所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；(3)CDR3：具有如SEQ ID NO.7‑9所示的任一序列或具有如SEQ ID NO.7‑9所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；所述轻链可变区的CDR区序列如下：(1)CDR1：具有如SEQ ID NO.10‑12所示的任一序列或具有如SEQ ID NO.10‑12所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；(2)CDR2：具有如SEQ ID NO.13‑15所示的任一序列或具有如SEQ ID NO.13‑15所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；(3)CDR3：具有如SEQ ID NO.16‑18所示的任一序列或具有如SEQ ID NO.16‑18所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。...

【技术特征摘要】
1.抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其片段能够特异性地结合α-突触核蛋白单体以及α-突触核蛋白聚合体；所述单克隆抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR区序列如下：(1)CDR1：具有如SEQIDNO.1-3所示的任一序列或具有如SEQIDNO.1-3所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；(2)CDR2：具有如SEQIDNO.4-6所示的任一序列或具有如SEQIDNO.4-6所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；(3)CDR3：具有如SEQIDNO.7-9所示的任一序列或具有如SEQIDNO.7-9所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；所述轻链可变区的CDR区序列如下：(1)CDR1：具有如SEQIDNO.10-12所示的任一序列或具有如SEQIDNO.10-12所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；(2)CDR2：具有如SEQIDNO.13-15所示的任一序列或具有如SEQIDNO.13-15所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；(3)CDR3：具有如SEQIDNO.16-18所示的任一序列或具有如SEQIDNO.16-18所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述重链可变区的FR区序列如下：(1)FR1：具有如SEQIDNO.19-21所示的任一序列或具有如SEQIDNO.19-21所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；(2)FR2：具有如SEQIDNO.22-24所示的任一序列或具有如SEQIDNO.22-24所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；(3)FR3：具有如SEQIDNO.25-27所示的任一序列或具有如SEQIDNO.25-27所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；(4)FR4：具有如SEQIDNO.28-30所示的任一序列或具有如SEQIDNO.28-30所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；所述轻链可变区的FR区序列如下：(1)FR1：具有如SEQIDNO.31-33所示的任一序列或具有如SEQIDNO.31-33所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；(2)FR2：具有如SEQIDNO.34-36所示的任一序列或具有如SEQIDNO.34-36所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；(3)FR3：具有如SEQIDNO.37-39所示的任一序列或具有如SEQIDNO.37-39所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；(4)FR4：具有如SEQIDNO.40-42所示的任一序列或具有如SEQIDNO.40-42所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；优选地，所述重链可变区具有如SEQIDNO.43-45所示的任一序列或具有如SEQIDNO.43-45所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；所述轻链可变区具有如SEQIDNO.46-48所示的任一序列或具有如SEQIDNO.46-48所示的任一序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的抗α-突触核蛋白的单克隆抗体或其片...

【专利技术属性】
技术研发人员：滕国生，高冷，殷玉和，吴丛梅，孙尧，牛晓辉，张凤英，
申请(专利权)人：长春工业大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22