TAT-TDRG1在制备治疗弱精子症药物中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种用于制备治疗弱精子症的重组蛋白，属于生物医学和分子诊断技术领域。该重组蛋白为TAT‑TDRG1。TDRG1在弱精子症的精子中表达水平显著下调，而TAT‑TDRG1重组蛋白可以显著提高弱精子症患者精子中的TDRG1含量，从而有效改善弱精子症精子的前向运动率，可作为一种治疗弱精子症的药物。

【技术实现步骤摘要】
TAT-TDRG1在制备治疗弱精子症药物中的应用
本专利技术属于生物医学和分子诊断
，具体涉及穿膜肽TAT-TDRG1融合蛋白的制备及成为治疗弱精子症药物中的应用。
技术介绍
当今，不孕不育症已成为全世界范围内的健康和社会问题，其中男性因素约占50％，且呈上升趋势。弱精子症(asthenospermia)是男性不育的主要病因之一。根据世界卫生组织规定，精液参数中前向运动精子比率小于32％的病症为弱精子症。引起精子活力低下的原因很多，包括外部环境、自身缺陷和遗传等因素，但弱精子症具体发病机制不明，严重阻碍了弱精子症临床诊断和治疗的进展，且尚未有治疗弱精子症的特效药。研究表明睾丸特异性蛋白含量下降或功能异常与弱精子症有关，改善弱精子症精子中这些相关蛋白含量和功能可能是治疗弱精子症的可行之法。然而，成熟精子是基因表达沉默的特化细胞，很难通过传统的分子生物学方法来调控基因表达。因此，通过穿膜肽将重组蛋白直接导入患者精子可能为弱精子症治疗提供新思路。但目前还未有通过穿膜肽导入重组蛋白改善人精子运动的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种TAT-TDRG1重组蛋白，该重组蛋白能够穿过精子细胞膜，提高弱精子症患者的精子前向运动率，可以作为一种治疗弱精子症药物。在弱精子症导致的不育症患者的精子中，其TDRG1表达水平显著下调，因而，可以通过检测TDRG1表达水平，来诊断患者是否患有不育症。采用TAT-TDRG1重组蛋白，利用TAT的穿膜能力以及对细胞无毒性影响的特点，将原本无法在非通透性的人精子膜中的表达的TDRG1蛋白携带并导入进人精子中，可显著恢复弱精子症患者的精子中的TDRG1表达水平，改善弱精子症病人前向运动率。用于将外源蛋白导入人精子的穿膜肽为1型人免疫缺陷病毒转录激活因子TAT，氨基酸序列为：YGRKKRRQRRR；导入精子外源重组蛋白为TDRG1(Testisdevelopment-relatedprotein1)，Uniprot序列号为Q3Y452，含有100个氨基酸，预测分子量为11KDa，氨基酸序列为：所述的TAT-TDRG1重组蛋白的制备，包括如下步骤：(1)构建pET28a-TAT-EGFP重组质粒；(2)TAT-EGFP在大肠杆菌中的表达和纯化；(3)TAT穿膜效应验证；(4)TAT融合蛋白对精子的影响；(5)构建pET28a-TAT-TDRG1重组质粒；(6)TAT-TDRG1融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化；上述制得的TAT-TDRG1融合蛋白导入人精子，对人精子前向运动率的有显著提高。本专利技术的有益效果在于：通过实验表明，本专利技术提供的TAT-TDRG1重组蛋白能显著提高弱精子症患者精子中的TDRG1含量，从而有效改善弱精子症精子前向运动率，为弱精子症的治疗提供了一个新的药物选择。同时，该TAT-TDRG1重组蛋白制备成本低，对于辅助生殖和精子运动改善药物的应用具有良好前景。附图说明图1：PCR产物及回收产物电泳图(A)、表达载体及PCR产物双酶切回收产物电泳图(B)。图A中Lane1和2：TAT-EGFPPCR产物；Lane3和4：TAT-EGFPPCR回收产物；LaneM：D2000DNAladder。图B中Lane1和2：TAT-EGFPPCR产物双酶切回收产物；LaneM1：D2000DNAladder；Lane3：pET28a双酶切回收产物；LaneM2：1kbDNAladder。图2：PCR产物及回收产物电泳图(A)、表达载体及PCR产物双酶切回收产物电泳图(B)。图A中Lane1：TDRG1PCR产物；Lane2：TDRG1PCR回收产物；LaneM：D2000DNAladder。图B中Lane1：TDRG1PCR产物双酶切；Lane2：pET28a-TAT-EGFP双酶切；Lane3：TDRG1PCR产物双酶切回收产物；Lane4：pET28a-TAT-EGFP双酶切回收线性载体；LaneM1：D2000DNAladder；LaneM2；1kbDNAladder。图3：菌检PCR电泳图(A)、部分测序后比对图(B)。图A中1、3、4、5、6、10、12、13、15为阳性克隆)；LaneM：D2000DNAladder；图B为阳性克隆提取质粒测序后序列比对结果。图4：菌检PCR电泳图(A)、测序比对图(B)。图A中Lane1-7：TAT-TDRG1菌检；LaneM：D2000DNAladder；(2为阴性，余为阳性)。图B是阳性克隆质粒抽提送测序后部分比对结果。图5：融合蛋白诱导表达后电泳图(A)、融合蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后电泳图(B)。图A中Lane1～6：转化pET-TAT-EGFP质粒，加0.5mMIPTG诱导，随机挑取的6个克隆(均出现大小正确的表达条带)；Lane4和8：负对照，转化pET-TAT-EGFP质粒、未加IPTG诱导；LaneM：FermentasPrestainedProteinMolecularWeightMarker。图B中Lane1和2：纯化的EGFP-TAT；Lane3-6：商业化BSA，浓度分别为0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.4mg/ml和0.8mg/ml；LaneM：FermentasPrestainedProteinMolecularWeightMarker。图6：不同浓度融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT与精子孵育不同时间的穿膜效果图。图7：融合蛋白的表达纯化和穿膜验证。A：构建的TAT-TDRG1原核表达在体在细菌中的表达情况，1表示未诱导，2诱导后的总蛋白，3诱导后细菌裂解沉淀(包涵体)，4诱导后细菌裂解上清。结果表明，TAT-TDRG1在细菌中过量表达，造成其主要在包涵体中，因此，需要进行复性实验。5-7表明复性后的进一步纯化结果，7中纯化到了纯度大于90％以上的可溶的TAT-TDRG1。B：不同浓度的重组TAT-TDRG1与正常人精子孵育2小时后，wash，提蛋白，分别用flagtag抗体(检测外源导入的TDRG1)和TDRG1抗体(总TDRG1)进行Westernblot，结果表明80ug/ml的TAT-FLAG-TDRG1具有最适的导入效果。图8：导入外源重组蛋白TAT-TDRG1精子活力变化统计图。A是总的52例样本总体结果，B是27例正常精子样本结果，C是25例弱精症样本结果，结果表明TAT-TDRG1导入精子后不仅能增加正常人的PR值(增加约10％)，而且能显著增加弱精的PR(40％)。具体实施方式下面结合具体实施例，对本专利技术作进一步地说明。实施例1TAT-EGFP及TAT-TDRG1融合蛋白的制备1、重组质粒pET28a-TAT-EGFP及pET28a-TAT-TDRG1的构建1.1EGFP基因的钓取1.1.1引物设计(引物设计序列详见表)pET28a-TAT-EGFP重组质粒的构建：根据载体pET28的特性和EGFP基因序列情况，我们设计引物EGFPN上游5′端，依次分别加入了保护碱基GGG、NdeI酶切位点(CATATG)、TAT序列和BamHI酶切位点(GGATCC)。表1：pET28a-TAT-EGFP重组质粒的引物设计序列*：引物融合NdeI(CATAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.TAT‑TDRG1在制备治疗弱精子症药物中的应用，其特征在于：该TAT‑TDRG1重组蛋白应用于治疗弱精子症药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.TAT-TDRG1在制备治疗弱精子症药物中的应用，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈厚仰，曾旭辉，汤育新，罗韬，孙捷，王共先，
申请(专利权)人：江西省妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：江西,36