【技术实现步骤摘要】
一种高通量筛选高产油裂殖壶菌突变体的方法
本专利技术属于基因工程
,尤其涉及一种高通量筛选高产油裂殖壶菌突变体的方法。
技术介绍
目前,最接近的现有技术:DHA的作用和功效二十二碳六烯酸(Docosahexenoicacid,DHA)是一种具有重要生理功能的ω-3系列长链不饱和脂肪酸,作为一种重要的营养成分,它具有促进婴幼儿大脑视网膜发育、预防多种心血管疾病以及提高机体免疫能力等重要生理功能。因此,DHA已被广泛应用于婴幼儿食品、保健品、医药和养殖等行业,人们对DHA的需求也日益增加。裂殖壶菌合成的富含DHA油脂是工业化生产DHA的新型来源。为了获得适用于工业化的高产油、高产DHA的裂殖壶菌工程株,我们设计了一套操作简单的基于尼罗红染色的高通量筛选方案。现有的筛选高产DHA裂殖壶菌突变株的方法主要有:1).菌株诱变后挑选生长快速的突变株,该方法主要是依据菌落形态大小来判断的,而且目标菌株往往需要多轮验证,因此,此方法存在肉眼观察不可确信性、工作量大和时间成本较高等缺点。2).诱变后添加相关酶抑制剂,该方法是通过抑制DHA合成通路中某个关键酶来反向筛选出该酶活性强的突变体,而判断依据往往也是通过菌落形态大小来判断,而且目标菌株也需要多轮验证。因此,此方法也存在方法一中同样的缺点,而且筛选出来的突变株存在特征单一性,不适用于工业应用。3).利用DHA的特性如抗氧化性和增加细胞流动性来改变筛选条件,此方法筛选依据方法一,假阳性较高,验证过程漫长。4).采用驯化手段,通过连续胁迫条件如高氧、高盐来驯化菌株,此方法虽能部分提高DHA产量,但其驯化周期过长,且易 ...
【技术保护点】
1.一种高通量筛选高产油裂殖壶菌突变体的方法,其特征在于,所述高通量筛选高产油裂殖壶菌突变体的方法包括:步骤一,接种培养:吸取筛选培养基于96孔板中,并挑取少量突变体单克隆于对应96孔板孔中,挑完后,让单克隆均匀分散于培养基中,在恒温摇床中培养;步骤二,OD595测量:将96孔板取出,吹扫各孔培养物后,利用多功能酶标仪高通量检测595nm吸光值;步骤三,尼罗红染色:利用排枪加20%DMSO水溶液于96孔黑色酶标板中,再将96孔板中的培养物转于96孔黑色酶标板中,加入后用排枪轻吹,再加入0.1mg/ml尼罗红试剂,然后用排枪轻吹混匀;锡箔纸包好后放于恒温水浴锅中水浴;孵育结束后取出酶标板,利用多功能酶标仪检测激发光波长为485±20nm,发射光波长为595±10nm的荧光强度,并扣除未染色菌液的荧光强度;步骤四,数据分析:将每两板96孔板中的荧光值与OD595值的比值的最大或最小的各五个突变体转板保存,并记录对应单克隆板的编号;步骤五,复筛:挑选步骤四中的FI/OD595前五的突变体进行复筛。
【技术特征摘要】
1.一种高通量筛选高产油裂殖壶菌突变体的方法,其特征在于,所述高通量筛选高产油裂殖壶菌突变体的方法包括:步骤一,接种培养:吸取筛选培养基于96孔板中,并挑取少量突变体单克隆于对应96孔板孔中,挑完后,让单克隆均匀分散于培养基中,在恒温摇床中培养;步骤二,OD595测量:将96孔板取出,吹扫各孔培养物后,利用多功能酶标仪高通量检测595nm吸光值;步骤三,尼罗红染色:利用排枪加20%DMSO水溶液于96孔黑色酶标板中,再将96孔板中的培养物转于96孔黑色酶标板中,加入后用排枪轻吹,再加入0.1mg/ml尼罗红试剂,然后用排枪轻吹混匀;锡箔纸包好后放于恒温水浴锅中水浴;孵育结束后取出酶标板,利用多功能酶标仪检测激发光波长为485±20nm,发射光波长为595±10nm的荧光强度,并扣除未染色菌液的荧光强度;步骤四,数据分析:将每两板96孔板中的荧光值与OD595值的比值的最大或最小的各五个突变体转板保存,并记录对应单克隆板的编号;步骤五,复筛:挑选步骤四中的FI/OD595前五的突变体进行复筛。2.如权利要求1所述高通量筛选高产油裂殖壶菌突变体的方法,其特征在于,步骤一中,用排枪吸取200μl筛选培养基于96孔板中;在恒温摇床中培养30h,培养条件:28℃,摇床转速200rpm。3.如权利要求1所述高通量筛选高产油裂殖壶菌突变体的方法,其特征在于,步骤二中,将96孔板取出,用200μl排枪轻吹各孔培养物后,放于多功能酶标仪检测595nm吸光值。4.如权利要求1所述高通量筛选高产油裂殖壶菌突变体的方法,其特征在于,步骤三中,用排枪取50μl20%DMSO水溶液于96孔黑色酶标板中;再加入4μl0.1mg/ml尼罗红试剂,然后用排枪轻吹混匀;用锡箔纸包好后放于40℃恒温水浴锅中水浴10min。5.如权利要求1所述高通量筛选高产油裂殖壶菌突变体的方法,其特征在于,步骤五中,复筛具体操作方法同步骤一~步骤四。6.如权利要求1所述高通量筛选高产油裂殖壶菌突变体的方法,其特征在于,进行接种培养前,需进行:利用紫外UVC诱变建立随机突变体库。7.如权利要求1所述高通量筛选高产油裂殖壶菌突变体的方法,其特征在于,所述高通量筛选高产油裂殖壶菌突变体的方法进一步包括:筛选条件优化:进行裂殖壶菌尼罗红染色条件优化、选用单位细胞密度油脂量作为筛选依据、确定尼罗红的染色时间点;对复筛中的FI/OD595前三的突变体,进行表型验证。8.如权利要求7所述高通量筛选高产油裂殖壶菌突变体的方法,其特征在于,裂殖壶菌尼罗红染色条件优化,具体有:1)取裂殖壶菌培养至对数期的培养液适量,3000g离心15min,弃上清,细胞沉淀用新鲜的种子培养基重悬,使细胞密度约为107个/mL,分别取1mL重悬液于棕色离心管中,分别加入250μL的一...
【专利技术属性】
技术研发人员:段光前,黄开耀,
申请(专利权)人:中国科学院水生生物研究所,
类型:发明
国别省市:湖北,42
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