银杏内生真菌代谢产物及在制备抗氧化剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种银杏内生真菌代谢产物及在制备抗氧化剂中的应用，所述代谢产物是由黄盖小脆柄菇(Psathyrella candolleana)Gb.PY‑F1发酵液经超声破碎、微滤、硅胶柱层析、凝胶Sephadex LH‑20柱分离、重结晶获得的。银杏内生真菌代谢产物Gf.6‑7‑23的CL50＝14.538μg/mg，阳性对照Vc的CL50＝15.261μg/mL，Gf.6‑7‑23对DPPH的清除能力与抗坏血酸效果几乎同等，而本发明专利技术通过微生物发酵的方法可制备得到，在一定程度上避免了植被的破坏，环保。

Metabolites of Endophytic Fungi from Ginkgo biloba and Their Application in the Preparation of Antioxidants

【技术实现步骤摘要】
银杏内生真菌代谢产物及在制备抗氧化剂中的应用(一)
本专利技术涉及一种对DPPH自由基具有较强清除能力的抗氧化剂剂，具体涉及一种内生真菌代谢产物及在制备抗氧化药物的应用。(二)
技术介绍
银杏(学名：GinkgobilobaL.)是裸子植物银杏科，属于落叶乔木，种子具长柄，下垂，通常椭圆形，倒卵形，卵球形或近圆形。肉质外种皮，白色到粉红色，肉质外种皮，成熟时黄色或橙色。银杏种子甜而苦，与医药、食品同源，含有多种活性底物，如黄酮类、萜内酯、银杏酸、苯丙酮类、酚类等。因此，它具有促进唾液分泌、止渴祛痘、改善脑功能、增强记忆、治疗阿尔茨海默病、扩张微血管、促进血液循环、平滑血管、治疗脑供血等多种保健功能。内生植物在各种植物中普遍存在。许多内生植物可以产生与宿主植物相同或相似的代谢产物，因此，利用植物内生菌筛选生物活性成分或先导化合物已成为寻找天然药物的又一重要途径，也是当前植物内生菌研究的热点。癌症、衰老或其它疾病大都与过量自由基的产生有关联。研究抗氧化可以有效克服其所带来的危害，所以抗氧化被保健品、化妆品企业列为主要的研发方向之一，也是市场最重要的功能性诉求之一。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种银杏内生真菌代谢产物及在制备抗氧化剂中的应用。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种银杏内生真菌代谢产物，所述代谢产物按如下方法制备：(1)将黄盖小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)Gb.PY-F1发酵液经超声破碎后抽滤，滤液用微滤膜过滤后用乙酸乙酯萃取，取有机相浓缩至恒重，获得代谢粗产物；所述黄盖小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)Gb.PY-F1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M2019125，保藏日期为2019年3月6日，保藏地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072；(2)将步骤(1)代谢粗产物用乙酸乙酯溶解后进行硅胶柱层析，以体积比100-0:0-100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集体积比50:50石油醚-乙酸乙酯的流出液，浓缩至干，记为组分Gf.6；(3)将步骤(2)组分Gf.6用乙酸乙酯溶解后再次进行硅胶柱层析，以体积比75:15石油醚-丙酮为流动相洗脱，收集第7个柱体积的流出液，浓缩至干，记为组分Gf.6-7；(4)组分Gf.6-7以体积比1:1的甲醇-三氯甲烷为洗脱剂进行凝胶SephadexLH-20柱分离，收集Rf值为0.6的流出液，浓缩至干，记为组分Gf.6-7-23；(5)步骤(4)组分Gf.6-7-23经甲醇溶解重结晶，获得晶体；将晶体用甲醇溶解后，以体积比10:5:5的丙酮：甲苯：氯仿为展开剂进行薄层层析，收集Rf为0.6的组分，获得银杏内生真菌代谢产物。进一步，所述步骤(1)所述发酵液按如下方法制备：将黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1接种于发酵培养基中，28℃，180r/min培养7d，获得发酵液；所述发酵培养基组成：硝酸钠3g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，蔗糖30g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.0～7.2。进一步，所述步骤(1)所述代谢粗产物按如下方法制备：在405W条件下，每工作3s，间歇4s，进行300次循环对发酵液进超声破壁处理后抽滤，取滤液经0.45μm微孔滤膜过滤后浓缩至原体积的1/3，用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩至恒重，获得代谢粗产物。进一步，所述步骤(2)操作条件为：将步骤(1)代谢粗产物用乙酸乙酯溶解，加入硅胶，研磨均匀后，真空干燥，即为吸附样品的硅胶；将吸附样品的硅胶上样于硅胶色谱柱中，采用体积比100-0:0-100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集体积比50:50石油醚-乙酸乙酯的流出液，浓缩至干，记为组分Gf.6；所述硅胶与发酵粗产物质量比为1.5：1。进一步，所述步骤(2)石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱体积比依次为100:0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100。进一步，所述步骤(3)操作条件为：将步骤(2)组分Gf.6用乙酸乙酯溶解，加入硅胶，研磨均匀后，真空干燥，即为吸附组分Gf.6的硅胶；将吸附组分Gf.6的硅胶上样于硅胶色谱柱中，以体积比75:15石油醚-丙酮为流动相洗脱，收集第7个柱体积的流出液，浓缩至干，记为组分Gf.6-7；所述硅胶与组分Gf.6质量比为1.5：1。进一步，所述步骤(4)操作条件为：组分Gf.6-7以体积比1:1的甲醇-三氯甲烷为洗脱剂进行凝胶SephadexLH-20柱分离，流速为1drop/s，收集Rf值为0.6的流出液，浓缩至干，记为组分Gf.6-7-23。更进一步，本专利技术所述银杏内生真菌代谢产物按如下方法制备：(1)将黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1接种于发酵培养基中，28℃，180r/min培养7d，获得发酵液；将发酵液超声破碎后抽滤，取滤液经微孔滤膜过滤后浓缩至原体积的1/3，用1倍体积乙酸乙酯萃取(优选萃取至乙酸乙酯相肉眼观察无明显颜色变化，合并乙酸乙酯萃取相)，有机相浓缩至恒重，获得代谢粗产物；(2)将步骤(1)代谢粗产物用微量乙酸乙酯溶解，加入硅胶(200～300目)，研磨均匀后，置于减压真空干燥器中干燥，即为吸附样品的硅胶，所述硅胶与发酵粗产物质量比为1.5：1；将吸附样品的硅胶上样于硅胶色谱柱(优选6cm*60cm)中，装柱量3/4，采用体积比100-0:0-100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集体积比50:50石油醚-乙酸乙酯的流出液，浓缩至干，记为组分Gf.6；(3)将步骤(2)组分Gf.6用乙酸乙酯溶解，加入硅胶，研磨均匀后，真空干燥，即为吸附组分Gf.6的硅胶；将吸附组分Gf.6的硅胶上样于硅胶色谱柱中，以石油醚-丙酮(v:v＝75:15)为流动相洗脱，收集第7个柱体积的流出液，浓缩制备，记为组分Gf.6-7；所述硅胶与组分Gf.6质量比为1.5：1；(4)将步骤(3)组分Gf.6-7用凝胶SephadexLH-20以甲醇-三氯甲烷(V:V＝1:1)为洗脱剂进行柱分离，流速为1drop/s，收集Rf值为0.6(展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝6:1)的流出液，浓缩至干，记为组分Gf.6-7-23；(5)步骤(4)组分Gf.6-7-23经甲醇溶解重结晶，得到晶体；将晶体用甲醇溶解后，以丙酮：甲苯：氯仿＝10:5:5(v/v/v)为展开剂进行薄层层析，收集Rf为0.6的组分，获得银杏内生真菌代谢产物，记为代谢产物Gf.6-7-23。本专利技术所述黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1，菌落呈白色放射状，干燥，产大量肉眼可见黄色色素，菌落老化后成浅黄棕色。本专利技术还提供一种所述银杏内生真菌代谢产物在制备抗氧化剂中的应用。本专利技术还提供一种所述银杏内生真菌代谢产物在制备抗氧化药物或化妆品中应用。与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：银杏内生真菌代谢产物Gf.6-7-23的CL50＝14.538μg/mg，阳性对照Vc的CL50＝15.261μg/mL，Gf.6-7-23对DPPH的清除能力与抗坏血酸效果几乎同等，而本专利技术通过微生物发酵的方法可制备得到，在一定程度上避免了植被的破坏，环保。(四)附图说明图1为Gb.PY-F1系本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种银杏内生真菌代谢产物，其特征在于所述代谢产物按如下方法制备：(1)将黄盖小脆柄菇(Psathyrella candolleana)Gb.PY‑F1发酵液经超声破碎后抽滤，滤液用微滤膜过滤后用乙酸乙酯萃取，取有机相浓缩至恒重，获得代谢粗产物；所述黄盖小脆柄菇(Psathyrella candolleana)Gb.PY‑F1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2019125，保藏日期为2019年3月6日，保藏地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072；(2)将步骤(1)代谢粗产物用乙酸乙酯溶解后进行硅胶柱层析，以体积比100‑0:0‑100的石油醚‑乙酸乙酯梯度洗脱，收集体积比50:50石油醚‑乙酸乙酯的流出液，浓缩至干，记为组分Gf.6；(3)将步骤(2)组分Gf.6用乙酸乙酯溶解后再次进行硅胶柱层析，以体积比75:15石油醚‑丙酮为流动相洗脱，收集第7个柱体积的流出液，浓缩至干，记为组分Gf.6‑7；(4)组分Gf.6‑7以体积比1:1的甲醇‑三氯甲烷为洗脱剂进行凝胶Sephadex LH‑20柱分离，收集Rf值为0.6的流出液，浓缩至干，记为组分Gf.6‑7‑23；(5)步骤(4)组分Gf.6‑7‑23经甲醇溶解重结晶，获得晶体；将晶体用甲醇溶解后，以体积比10:5:5的丙酮：甲苯：氯仿为展开剂进行薄层层析，收集Rf为0.6的组分，获得银杏内生真菌代谢产物。...

【技术特征摘要】
1.一种银杏内生真菌代谢产物，其特征在于所述代谢产物按如下方法制备：(1)将黄盖小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)Gb.PY-F1发酵液经超声破碎后抽滤，滤液用微滤膜过滤后用乙酸乙酯萃取，取有机相浓缩至恒重，获得代谢粗产物；所述黄盖小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)Gb.PY-F1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M2019125，保藏日期为2019年3月6日，保藏地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072；(2)将步骤(1)代谢粗产物用乙酸乙酯溶解后进行硅胶柱层析，以体积比100-0:0-100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集体积比50:50石油醚-乙酸乙酯的流出液，浓缩至干，记为组分Gf.6；(3)将步骤(2)组分Gf.6用乙酸乙酯溶解后再次进行硅胶柱层析，以体积比75:15石油醚-丙酮为流动相洗脱，收集第7个柱体积的流出液，浓缩至干，记为组分Gf.6-7；(4)组分Gf.6-7以体积比1:1的甲醇-三氯甲烷为洗脱剂进行凝胶SephadexLH-20柱分离，收集Rf值为0.6的流出液，浓缩至干，记为组分Gf.6-7-23；(5)步骤(4)组分Gf.6-7-23经甲醇溶解重结晶，获得晶体；将晶体用甲醇溶解后，以体积比10:5:5的丙酮：甲苯：氯仿为展开剂进行薄层层析，收集Rf为0.6的组分，获得银杏内生真菌代谢产物。2.如权利要求1所述银杏内生真菌代谢产物，其特征在于步骤(1)所述发酵液按如下方法制备：将黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1接种于发酵培养基中，28℃，180r/min培养7d，获得发酵液；所述发酵培养基组成：硝酸钠3g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，蔗糖30g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.0～7.2。3.如权利要求1所述银杏内生真菌代谢产物...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘芸，杨胜利，张慧，邵泽辉，杨锡，陈萍，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33