两个同时靶向基因xa13，xa25并高效创制抗白叶枯水稻的gRNA序列制造技术

本发明专利技术公开了一段长度为30bp的碱基序列5’‑ TCGGTGCCGTACGTGGTGGCGCTCTTCAGC ‑3’，该序列是水稻白叶枯感病基因xa13与xa25唯一一段较长的同源序列，并利用该序列公开了两个可以同时靶向敲除xa13与xa25感病基因的gRNA。利用该gRNA可以筛选并获得双基因突变的广谱高抗白叶枯的水稻新材料，该发明专利技术为广谱持久抗病材料的创制提供一种高效的育种方式，同时对水稻白叶枯病的防治研究具有重要的意义。

Two Simultaneous Targeting Genes xa13, xa25 and Efficient Generation of gRNA Sequences of Bacterial Blight Resistant Rice

【技术实现步骤摘要】
两个同时靶向基因xa13，xa25并高效创制抗白叶枯水稻的gRNA序列
本专利技术涉及基因遗传育种领域，尤其涉及一种高效创制抗白叶枯水稻的方法。
技术介绍
水稻白叶枯病（BacterialBlight,BB）是水稻生产上危害最大的细菌性病害之一，它由革兰氏阴性菌黄单胞杆菌水稻变种（Xanthomonasoryzaepv.oryzae,Xoo）所引起，病菌通常从气孔或伤口侵入水稻，沿维管束传播并蔓延至整个植株，最终是叶片产生灰白色病斑，病害导致植株的光合作用受到影响，轻则减产10%-20%，严重时减产30%-50%。此外，一般种植的水稻恢复系中仅含单一的抗性基因。这使得水稻对白叶枯病的抗谱有限，并且难以应付白叶枯病菌不断的更新变异。可见，广谱持久抗病材料的创制对水稻白叶枯病的防治研究具有重要的意义。目前，已经成功克隆的百叶枯抗性相关基因有Xa21、Xa1、Xa26、Xa27、xa5、xa13、xa25等7个基因。其中前面四个为白叶枯主效抗性基因，后面三个为白叶枯主效感病基因。传统的抗性基因的利用主要通过杂交聚合和转基因选育两种方式，这些资源应用于育种需要通过不断杂交和回交才能将抗病基因整合到现代水稻品种中，所需时间长，且存在遗传累赘，外源基因等利用困难现象。感病基因xa5编码产物是Ⅱ型转录因子TFIIA的γ亚基，通过抑制Xoo的转移使水稻获得白叶枯病抗性。而xa13与xa25分别编码一个含有307，296个氨基酸的质膜蛋白，都属于MtN3/saliva家族。这两个感病基因分别为病菌的侵染扫除铜离子毒害和为病菌的繁殖提供营养物质，因此有利于病原菌的生长，促进水稻的感病反应，而当该基因发生碱基突变时，就不能启动感病反应。这些研究表明，这些感病基因可以作为的基因组编辑靶点来创制抗白叶枯新材料。CRISPR/CAS9基因组编辑技术，已经成为精确培育作物、改善重要农艺性状的有力工具，如生长期、抗逆境、抗病性、基因雄性不育性、营养品质和产量提高。在作物抗性方面，最早报道的，是利用TALEN基因组编辑技术靶向Os11N3基因来创制抗性材料，而广谱抗性材料的获得一般通过多个gRNA介导的多基因编辑来获得，目前还没有研究报告。因此，基于以上背景，创制一种简单高效的白叶枯广谱高抗育种体系对水稻生产实践具有重要意义。
技术实现思路
基于
技术介绍
，本专利技术的目的是公开了一段长度为30bp的水稻白叶枯感病基因xa13与xa25的同源序列,并基于该序列提供一种效创制抗白叶枯水稻的方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：水稻白叶枯感病基因xa13与xa25的同源序列，其特征在于，所述序列如SEQIDNO.1所示。利用同源序列生成同时靶向基因xa13，xa25的gRNA序列，其特征在于，包括如下序列：gRNA1：5’-TCGGTGCCGTACGTGG-3’；gRNA2：5’-CCGTACGTGGTGGCGCTCTTCAGC-3’。一种利用gRNA序列创制抗白叶枯水稻的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）选择xa13与xa25基因无失活突变的拟改良水稻品种材料诱导愈伤，作为受体材料；（2）构建gRNA1和gRNA2基因编辑载体，用农杆菌介导法将打靶载体导入拟改良水稻品种的愈伤组织；（3）获得抗性愈伤诱导阳性植株，并鉴定阳性植株的目的基因xa13及xa25突变情况，选取纯合突变植株进行表型考察，查看抗性能力。本实验采用基因编辑技术为第三代基因编辑技术CRISPR/cas9，所使用的载体为人工合成重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA（环形载体），骨架载体pCXUN-Cas9为市面上订购的常见线性载体，（本实验购于北京唯尚立德生物科技有限公司），cas9蛋白序列全长4206个碱基对，编码1401个氨基酸。其表达由Ubiquitin启动子驱动，gRNA由U6启动子驱动。gRNA片段由引物合成公司合成后通过DNA连接酶连接在U6启动子之后形成重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA（环形载体）。利用农杆菌介导水稻愈伤遗传转化方法，将鉴定正确的载体通过电击转化到农杆菌LBA4404中,将阳性的克隆用于水稻愈伤组织转化。鉴定抗性愈伤诱导阳性植株，并检测其目的基因xa13及xa25突变情况，选取纯合突变植株进行表型考察，查看抗性能力。与现在技术相比，本专利技术的有益成果在于：（1）本专利技术首次公开了一公开了一段长度为30bp的碱基序列TCGGTGCCGTACGTGGTGGCGCTCTTCAGC，并利用基因组编辑技术定向打靶功能来实现该段序列的碱基修饰，相比传统方式，该系统一个gRNA可以同时靶向两个水稻白叶枯感病基因，简单易行、成本更低、效率高、抗谱广等特点。（2）本专利技术利用基因组编辑技术对xa13与xa25两个感病基因进行敲除，可快速实现大部分感病材料的遗传改良。为创制白叶枯广谱高抗育种种制资源提供了一种高效的育种方式，对水稻生产实践具有重要意义。附图说明图1为水稻xa13和xa25基因的同源基因序及基因编辑靶位点。其中黑色方框表示外显子，黑色线条表示内含子，灰色方框和字体表示同源序列，Cas9识别序列用箭头所示，位于基因第三外显子处。图2为双突变材料的白叶枯接种考察。左边为实施例1玉香油占野生型和双基因突变体接种Xoo99第10天的病斑发生图片；右边为实施例2五香丝苗野生型和双基因突变体接种Xoo99第10天的病斑发生图片。图3为实施例1玉香油占改良材料广谱抗性接种鉴定。图4为实施例2五香丝苗改良材料广谱抗性接种鉴定。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中所使用的实验验方法如没有特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的的实验材料如无特别说明均为市售购买产品。本专利技术中，将所述载体pCXUN-Cas9-gRNA转化粳稻、籼稻和糯稻的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用农杆菌介导法实现遗传转化，并经抗性愈伤的筛选、分化和生根创制广谱高抗白叶枯新材料，以下玉香油占和五山丝苗为例进行介绍，具体步骤如下：实施例1：gRNA2介导改良玉香油占创制广谱高抗白叶枯改良新材料（A）水稻xa13和xa25基因序列分析及打靶载体构建利用基因特异性引物13-f:TTAATAACCTTCATCACCAGTAGC/13-r:CTGTCGTCGTCGAGATCAGT；25-f:ATTACCCCCCTTTTAGCACA/25-r:TGCAAGCACGCGTTGACC分别扩增水稻xa13和xa25基因序列基因序列如序列SEQIDNO.8、SEQIDNO.9所示。序列分析显示，xa13基因含有5个外显子，xa25基因含有6个外显子，包含一个完整的表达框，表明基因功能正常，满足进一步编辑的条件。且上述两个基因的同源序列5’-TCGGTGCCGTACGTGGTGGAGC-3’无碱基差异，因此我们选择上述提供的gRNA2构建到cas9表达载体里，所使用的载体为人工合成重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA（环形载体），骨架载体pCXUN-Cas9为市面上订购的常见线性载体，（本实验购于北京唯尚立德生物科技有限公司）。（B）农杆菌介导水稻遗传转化本实施例中，将所述载体pCXUN-Cas9-gRNA转化粳稻、籼稻和糯稻的愈伤组织作为遗传转化的受体材料本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.水稻白叶枯感病基因xa13与xa25的同源序列，其特征在于，所述序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.水稻白叶枯感病基因xa13与xa25的同源序列，其特征在于，所述序列如SEQIDNO.1所示。2.利用权利要求1所述的同源序列生成同时靶向基因xa13，xa25的gRNA序列，其特征在于，包括如下序列：gRNA1：5’-TCGGTGCCGTACGTGG-3’；gRNA2：5’-CCGTACGTGGTGGCGCTCTTCAGC-3’。3.一种利用权利要求2所述的gRNA序列创制抗白叶枯水稻的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：王锋，朱义旺，林雅容，陈建民，周军爱，梅法庭，陈睿，郭新睿，
申请(专利权)人：福建省农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35