本发明专利技术涉及Bna‑miR393在调控甘蓝型油菜生殖器官发育过程中的应用。具体涉及分离、克隆和应用一种包含Bna‑miR393前体序列（pre‑miR393）的DNA片段，其序列如SEQ ID NO:1所示，序列长度为618 bp，其对应的成熟miRNA序列如SEQ ID NO:2所示。甘蓝型油菜遗传转化的功能分析表明Bna‑miR393参与调控甘蓝型油菜生殖器官的发育，这对于甘蓝型油菜遗传育种改良具有十分重要的意义。
Application of Bna-mi393 in the Regulation of Reproductive Organ Development in Brassica napus
【技术实现步骤摘要】
Bna-miR393在调控甘蓝型油菜生殖器官发育过程中的应用
本专利技术涉及甘蓝型油菜基因工程领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种能够影响生殖器官发育的甘蓝型油菜Bna-miR393在甘蓝型油菜遗传育种改良中的应用。本专利技术采用RT-PCR的方法，分离到包含甘蓝型油菜Bna-miR393前体序列的DNA片段，过量表达Bna-miR393能够影响甘蓝型油菜生殖器官的发育，证实了该miRNA的功能及其应用途径。
技术介绍
甘蓝型油菜（BrassicanapusL.）是我国主要的油菜栽培种类，具有高产、抗逆性强、适应性广等特点。miRNA是一类长度约为21-24nt的内源非编码小RNA。植物miRNA是由DCL1剪切酶对初始转录物剪切加工而来，成熟的miRNA序列与RNA介导的沉默复合体结合，识别与miRNA序列互补的靶基因，最终通过对靶基因进行剪切或翻译抑制来实现对靶基因的调控。随着高通量测序技术的发展，大量研究发现miRNA参与植物生长发育的多个方面，包括种子萌发、叶片形态、花的分化与发育、根的发育、营养期到生殖期的转变等（D'ArioM,Griffiths-JonesS,KimM.SmallRNAs:bigimpactonplantdevelopment.TrendsPlantSci,2017,22(12):1056-1068）；此外，miRNA在植物抗病以及抵御非生物胁迫等方面也具有重要作用。miR393是植物中较为保守的miRNA家族，其靶基因编码生长素受体蛋白TIR1、AFB1/2/3等，该类蛋白参与生长素信号感知和Aux/IAA蛋白降解，而Aux/IAA蛋白可以通过与ARF等互作抑制生长素相关基因表达，从而调控植物生长发育、以及对生物和非生物胁迫的应答（ParryG,Calderon-VillalobosLI,PriggeM,etal.ComplexregulationoftheTIR1/AFBfamilyofauxinreceptors.ProcNatlAcadSciUSA,2009,106(52):22540-22545）。研究表明，miR393在植物抗菌性过程中的关键性作用，拟南芥中过表达miR393可以提高植株对外源病菌细菌感染的抵抗能力（NavarroL,DunoyerP,JayF,etal.AplantmiRNAcontributestoantibacterialresistancebyrepressingauxinsignaling.Science,2006,312(5772):436）。利用转基因技术获得生殖器官形态表型完全不同的甘蓝型油菜目前尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供甘蓝型油菜Bna-miR393的序列及功能，并进一步公开该miRNA在调控甘蓝型油菜生殖器官发育中的应用。本专利技术以甘蓝型油菜为研究材料，通过前期甘蓝型油菜的生殖器官不同发育时期RNA-seq比较分析，发现Bna-miR393在甘蓝型油菜的生殖器官发育过程中明显差异表达，说明该miRNA可能参与调控甘蓝型油菜生殖器官的发育。因此，从甘蓝型油菜中分离包含甘蓝型油菜Bna-miR393前体序列的DNA片段，并鉴定Bna-miR393在甘蓝型油菜生殖器官发育过程中所发挥的功能，对于甘蓝型油菜遗传育种改良将具有非常重要的意义。本专利技术分离和应用一种包含Bna-miR393前体序列（又称为前体miRNA，前体miRNA（pre-miRNA）是618bp中的一部分）的DNA片段，其序列如SEQIDNO:1所示，序列长度为618bp，其对应的miRNA成熟序列如SEQIDNO:2所示，该成熟miRNA具有调控甘蓝型油菜生殖器官发育的能力。利用农杆菌介导法转化到野生型甘蓝型油菜植株中，并研究其在甘蓝型油菜体内的生物学功能，为Bna-miR393在甘蓝型油菜遗传育种的应用提供了很好的基础。本专利技术的一个目的是获得调控甘蓝型油菜生殖器官发育的成熟miRNA，其序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术的又一个目的是提供含有前述DNA片段的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。本专利技术的又一个目的是提供（a1）或（a2）的应用：（a1）前述的甘蓝型油菜Bna-miR393，或前述的DNA片段，或前述的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调控甘蓝型油菜生殖器官发育、生殖器官形态表型中的应用；（a2）前述的甘蓝型油菜Bna-miR393，或前述的DNA片段，或前述的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在甘蓝型油菜遗传育种中的应用。本专利技术还提供一种改变目标植物生殖器官形态的转基因植物的培育方法，为提高目标植物中所述miRNA的含量，得到转基因植物；用前述的包含甘蓝型油菜Bna-miR393前体序列的DNA片段转化目标植物，获得转基因植物；所述转基因植物的生殖器官形态表型明显区别于所述目标植物。培育方法具体包括下述步骤：（1）克隆包含甘蓝型油菜Bna-miR393前体序列的DNA片段；（2）利用电击法将带有甘蓝型油菜Bna-miR393前体序列的质粒转化农杆菌；（3）将带有转化质粒的农杆菌采用转基因方法转化目标植物，得到转基因植物。携带有本专利技术包含Bna-miR393前体序列的DNA片段的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体，直接DNA转化、微注射、电击转化等常规生物技术方法导入植物细胞（Weissbach,1998,MethodforPlantMolecularBiologyVIII,AcademyPress,NewYork,pp.411-463;GeisersonandCorey,1998,PlantMolecularBiology(2ndEdition)）。可使用包括本专利技术的包含Bna-miR393前体序列的DNA片段的表达载体转化宿主（包括甘蓝型油菜在内的多种植物），培育株型改良的植物品种。利用DNA回收试剂盒回收上述包含Bna-miR393前体序列的DNA片段，利用酶切连接的方法将此片段连入pMDC83骨架载体，构建该DNA片段的过量表达载体，命名为pMDC83-miR393。利用电转法将pMDC83-miR393载体导入根癌农杆菌中，根癌农杆菌菌株为GV3101。通过农杆菌侵染介导的遗传转化方法将pMDC83-miR393转化甘蓝型油菜受体材料J9712，成功获得了Bna-miR393表达量相对于野生型显著提高的转基因植株，观察发现，与野生型植株相比，过表达Bna-miR393的转基因甘蓝型油菜生殖器官形态发生明显变化，说明Bna-miR393能够调控植物生殖器官的发育。综上所述，本专利技术以甘蓝型油菜为研究材料，通过分析过表达Bna-miR393转基因甘蓝型油菜植株的生殖器官的表型变化，发现了一个能够调控甘蓝型油菜生殖器官发育的候选miRNA，该miRNA可能在生殖器官的发育过程中起重要作用，并为甘蓝型油菜的遗传育种提供重要的理论基础。附图说明序列表SEQIDNO:1是本专利技术分离克隆的包含Bna-miR393前体序列的DNA片段，其长度为618bp；序列表SEQIDNO:2是成熟Bna-miR393的序列；图1Bna-miR393在甘蓝型油菜各个组织中的表达情况；图2Bna-miR393本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.包含甘蓝型油菜Bna‑miR393前体序列的DNA片段，其特征在于，所述的DNA片段的序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.包含甘蓝型油菜Bna-miR393前体序列的DNA片段，其特征在于，所述的DNA片段的序列如SEQIDNO:1所示。2.甘蓝型油菜Bna-miR393，其特征在于，其成熟序列如SEQIDNO:2所示。3.权利要求1所述的包含甘蓝型油菜Bna-miR393前体序列的DNA片段或权利要求2所述的甘蓝型油菜Bna-miR393在调控甘蓝型油菜生殖器官发育中的应用。4.含有权利要求1所述的DNA片段的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。5.（a1）或（a2）的应用：（a1）权利要求2所述的甘蓝型油菜Bna-miR393，或权利要求1所述的DNA片段，或权利要求4所述的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调控甘蓝型油菜生殖器官发育、生殖器官形态表型中的应用；（a2）权利要求2所述的甘蓝型油菜B...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋金金，朱双，王幼平，袁溢，谢涛，曾蕾，杜坤，张顺仓，吴德伟，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。