本发明专利技术涉及一种抗肿瘤补骨脂多糖的制备方法，具体为：1）补骨脂粉碎，依次用石油醚、70±5%乙醇室温浸提，超纯水加热提取，滤液经浓缩、醇沉得补骨脂粗多糖；2）将补骨脂粗多糖采用Sevag法脱蛋白，将得到的上清液减压浓缩、醇沉，取沉淀物干燥，即得脱蛋白的补骨脂粗多糖；3）取脱蛋白的补骨脂粗多糖，用DEAE‑52纤维素色谱柱纯化，依次用超纯水、0.05、0.1、0.2、0.3mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，蒸馏水的洗脱峰为组分PC‑1，0.2 mol/L NaCl溶液的洗脱峰为组分PC‑4；4）组分PC‑1、PC‑4分别经Sephadex G‑100葡聚糖凝胶柱色谱纯化得到的多糖组分命名为PCp‑1、PCp‑4；PCp‑1和/或PCp‑4即为抗肿瘤补骨脂多糖。经试验发现：该补骨脂多糖能有效抑制A549细胞的活性，可用于制备抗肿瘤尤其是抗肺癌药物。
An Anti-Tumor Psoralea Lipopolysaccharide and Its Extraction and Separation Method and Its Application in the Preparation of Anti-Tumor Drugs
【技术实现步骤摘要】
一种抗肿瘤补骨脂多糖及其提取分离方法和在制备抗肿瘤药物方面的应用
本专利技术属于中药提取
，具体涉及一种抗肿瘤活性补骨脂多糖、提取分离方法和在制备抗肿瘤药物方面的应用。
技术介绍
随着人口老龄化加剧、生态环境遭受破坏、不健康生活方式及食品安全问题等凸现，肿瘤发病率和死亡率持续上升，给人们生活、健康及社会带来严重危害。常见的肿瘤药物及放疗、化疗等虽然具有一定的治疗效果，但副作用较大。中药是我国的医学宝库，中药往往具有多靶点、低毒性、作用持久等特点，中医单独或辅助西药治疗肿瘤在提高机体免疫力、延长生存期、降低复发转移率及减轻副作用等方面有着积极的意义。因此以传统中药为来源研发新型天然抗肿瘤药物，是抗肿瘤药物研究的一个重点方向。补骨脂为豆科植物补骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果实，为传统中药。按照《卫生部关于进一步规范保健食品原料管理的通知》（卫法监发[2002]51号）中执行，补骨脂为可用于保健食品的物品。现代研究表明，补骨脂含有香豆素类、黄酮类、单萜类等多种成分，显示出抗炎、抗菌、抗氧化、降血糖等多种功效。关于补骨脂多糖的研究，目前仅国内几位学者对补骨脂粗多糖的含量及其免疫活性进行了初步研究，未见对补骨脂粗多糖的进一步分离纯化，得到单一的多糖组分,对其进行结构分析及抗肿瘤活性研究。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术缺陷，提供一种从补骨脂中提取分离得到、具有抗肿瘤活性的补骨脂多糖。本专利技术还提供了上述补骨脂多糖的提取分离方法和在制备抗肿瘤药物方面的应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种抗肿瘤补骨脂多糖的制备方法，其包括如下步骤：1）制备粗多糖：补骨脂粉碎，先用石油醚室温浸提脱脂，残渣挥干石油醚，再用70±5%乙醇室温浸提以除去色素及小分子成分，残渣挥发至无乙醇味，然后用超纯水于85±5℃加热提取，提取结束后趁热用布氏漏斗抽滤，滤液浓缩获得浓缩液，然后向浓缩液中加入无水乙醇使终浓度为70-75%，静置，收集沉淀，依次无水乙醇、丙酮洗涤沉淀，挥干溶剂即得补骨脂粗多糖；2）制备脱蛋白的补骨脂粗多糖：将补骨脂粗多糖用超纯水完全溶解获得补骨脂粗多糖溶液，采用Sevag法脱蛋白，将得到的上清液减压浓缩后加入无水乙醇至终浓度为75±2%，静置，离心，取沉淀物，干燥，即得脱蛋白的补骨脂粗多糖；3）取脱蛋白的补骨脂粗多糖，超纯水溶解，离心除去不溶物，然后上样到DEAE-52纤维素色谱柱，依次用超纯水、0.05、0.1、0.2、0.3mol/LNaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测定490nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制多糖洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品、浓缩，透析、冷冻干燥；其中，蒸馏水的洗脱峰为组分PC-1，0.2mol/LNaCl溶液的洗脱峰为组分PC-4；4）组分PC-1用超纯水溶解，上样到SephadexG-100葡聚糖凝胶柱色谱，用超纯水洗脱，采用苯酚-硫酸法进行检测，测定490nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制多糖洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品，浓缩、透析、冷冻干燥后得到的多糖组分命名为PCp-1；组分PC-4采用与组分PC-1相同的方法进行洗脱，合并同一洗脱峰的多糖样品，浓缩、透析、冷冻干燥后得到的多糖组分命名为PCp-4；PCp-1和/或PCp-4即为抗肿瘤补骨脂多糖。具体的，步骤1）中，用石油醚室温浸提脱脂3-5次，每次2-4d；用70±5%乙醇室温浸提3-5次，每次2-4d；超纯水加热提取2-4次，每次3-5h。具体的，步骤2）中，Sevag法脱蛋白时，所用Sevag试剂由体积比为4:1的氯仿和正丁醇组成；Sevag试剂添加量为补骨脂粗多糖溶液体积的1/4到1/2，优选1/3。本专利技术还提供了采用上述方法制备得到的抗肿瘤补骨脂多糖。本专利技术还提供了上述补骨脂多糖在制备抗肿瘤药物或食品中的应用。进一步的，优选上述补骨脂多糖在制备抗肺癌药物或食品中的应用。和现有技术相比，本专利技术的有益效果：本专利技术采用特殊的提取分离方法从补骨脂中分离得到多糖组分PCp-1和PCp-4，并以非小细胞肺癌A549细胞为例对该多糖组分的抗肿瘤作用进行考察，试验结果表明：该补骨脂多糖能有效抑制A549细胞的活性，说明其具有良好的抗肿瘤作用，可用于制备抗肿瘤药物，尤其是可用于制备抗肺癌药物或食品。附图说明图1补骨脂粗多糖DEAE-52纤维素色谱柱洗脱曲线；图2组分PC-1和PC-4经SephadexG-100凝胶柱色谱洗脱曲线；图3标准单糖混合物的GC色谱图；图4PCp-1的水解物GC色谱图；图5PCp-4的水解物GC色谱图。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术的技术方案作进一步地详细介绍，但本专利技术的保护范围并不局限于此。实施例11、一种抗肿瘤补骨脂多糖的制备方法，其具体包括如下步骤：1）制备粗多糖：补骨脂（4.4kg）粉碎，用石油醚室温浸提3次，每次3d，进行脱脂处理。提取后的残渣挥干石油醚，再用70%乙醇室温浸提4次，每次3d，提取后的残渣挥发至无乙醇味（石油醚、70%乙醇添加量以浸没补骨脂为宜）。然后用超纯水于85℃加热提取2次（加热提取时料液比约为1g：20mL），每次5h；提取结束后趁热用布氏漏斗抽滤，合并滤液，滤液旋转蒸发浓缩至原体积的1/4左右，获得浓缩液。向浓缩液中加入无水乙醇使终浓度为70%（体积百分比，下同），室温静置12h，离心弃去上清液，收集沉淀，依次无水乙醇、丙酮洗涤沉淀，挥干溶剂即得补骨脂粗多糖。2）上述制备的补骨脂粗多糖，用超纯水完全溶解获得补骨脂粗多糖溶液，采用Sevag法脱蛋白，具体为：按照补骨脂粗多糖溶液体积的1/3加入Sevag试剂，磁力搅拌震荡30min，4000r/min离心5min，除去中间变性蛋白质和下层有机溶剂，将上清液继续重复上述操作，直至无变性蛋白层出现；Sevag试剂由体积比为4:1的氯仿和正丁醇组成。将最终得到的上清液减压浓缩后加入无水乙醇至最终乙醇浓度为70%，室温静置12h，离心，取沉淀物，干燥，即得脱蛋白的补骨脂粗多糖。3）取上述脱蛋白后补骨脂粗多糖1.0g，用10mL超纯水溶解，高速离心除去不溶物，然后上样到DEAE-52纤维素色谱柱，依次用蒸馏水、0.05、0.1、0.2、0.3mol/LNaCl溶液进行梯度洗脱，分别洗脱400、800、800、800、700mL，流速控制在1.0mL/min，每5min收集一管，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，用酶标仪测定490nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制多糖洗脱曲线（洗脱曲线如图1所示）。合并同一洗脱峰的多糖溶液，50℃减压浓缩，透析（室温、截留分子量为8000-14000，刚开始每隔3h换一次水，共计三次，随后每隔12h换一次水，共计两次）、冷冻干燥机中冷冻干燥，其中，蒸馏水的洗脱峰为组分PC-1，0.2mol/LNaCl溶液的洗脱峰为组分PC-4。4）取200mg组分PC-1，用2mL超纯水溶解，上样到SephadexG-100葡聚糖凝胶色谱柱（1.5×100cm）进一步分离纯化，用超纯水洗脱，流速控制在0.8mL/min，每5min收集一管，采用苯酚-硫酸法进行检测，测定490本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗肿瘤补骨脂多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1）制备粗多糖：补骨脂粉碎，先用石油醚室温浸提脱脂，残渣挥干石油醚，再用70±5%乙醇室温浸提，残渣挥发至无乙醇味，然后用超纯水于85±5℃加热提取，提取结束后趁热抽滤，滤液浓缩获得浓缩液，然后向浓缩液中加入无水乙醇使终浓度为70‑75%，静置，收集沉淀，即得补骨脂粗多糖；2）制备脱蛋白的补骨脂粗多糖：将补骨脂粗多糖用超纯水完全溶解获得补骨脂粗多糖溶液，采用Sevag法脱蛋白，将得到的上清液减压浓缩后加入无水乙醇至终浓度为75±2%，静置，离心，取沉淀物，干燥，即得脱蛋白的补骨脂粗多糖；3）取脱蛋白的补骨脂粗多糖，超纯水溶解，离心除去不溶物，然后上样到DEAE‑52纤维素色谱柱，依次用超纯水、0.05、0.1、0.2、0.3mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱液采用苯酚‑硫酸法进行检测，测定490 nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制多糖洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品、浓缩，透析、冷冻干燥；其中，蒸馏水的洗脱峰为组分PC‑1，0.2 mol/L NaCl溶液的洗脱峰为组分PC‑4；4）组分PC‑1用超纯水溶解，上样到Sephadex G‑100葡聚糖凝胶柱色谱，用超纯水洗脱，采用苯酚‑硫酸法进行检测，测定490 nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制多糖洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品，浓缩、透析、冷冻干燥后得到的多糖组分命名为PCp‑1；组分PC‑4采用与组分PC‑1相同的方法进行洗脱，合并同一洗脱峰的多糖样品，浓缩、透析、冷冻干燥后得到的多糖组分命名为PCp‑4；PCp‑1和/或PCp‑4即为抗肿瘤补骨脂多糖。...
【技术特征摘要】
1.一种抗肿瘤补骨脂多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1）制备粗多糖：补骨脂粉碎，先用石油醚室温浸提脱脂，残渣挥干石油醚，再用70±5%乙醇室温浸提，残渣挥发至无乙醇味，然后用超纯水于85±5℃加热提取，提取结束后趁热抽滤，滤液浓缩获得浓缩液，然后向浓缩液中加入无水乙醇使终浓度为70-75%，静置，收集沉淀，即得补骨脂粗多糖；2）制备脱蛋白的补骨脂粗多糖：将补骨脂粗多糖用超纯水完全溶解获得补骨脂粗多糖溶液，采用Sevag法脱蛋白，将得到的上清液减压浓缩后加入无水乙醇至终浓度为75±2%，静置，离心，取沉淀物，干燥，即得脱蛋白的补骨脂粗多糖；3）取脱蛋白的补骨脂粗多糖，超纯水溶解，离心除去不溶物，然后上样到DEAE-52纤维素色谱柱，依次用超纯水、0.05、0.1、0.2、0.3mol/LNaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测定490nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制多糖洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品、浓缩，透析、冷冻干燥；其中，蒸馏水的洗脱峰为组分PC-1，0.2mol/LNaCl溶液的洗脱峰为组分PC-4；4）组分PC-1用超纯水溶解，上...
【专利技术属性】
技术研发人员：尹震花，康文艺，陈金花，张伟，张娟娟，
申请(专利权)人：黄河科技学院，
类型：发明
国别省市：河南,41
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