一种无糖基化抗PD-1单克隆抗体的纯化方法技术

本发明专利技术属于医药技术领域，涉及到蛋白纯化技术，具体公开了一种无糖基化抗PD‑1单克隆抗体的纯化方法。亲和层析过程中，引入盐成分，能够显著地改善亲和层析性能，降低蛋白浊度。洗涤和洗脱过程引入甘氨酸‑盐酸缓冲液，可有效减少聚体产生，增加蛋白稳定性。在病毒灭活过程中，加入了糖类物质，起到保护作用从而减少聚体形成，使抗体在低pH灭活下聚体增加变缓。本发明专利技术很好的减少了无糖基化抗pd‑1单克隆抗体纯化过程中聚体的形成，保护了蛋白的稳定性。

Purification of a glycosylated anti-PD-1 monoclonal antibody

【技术实现步骤摘要】
一种无糖基化抗PD-1单克隆抗体的纯化方法
本专利技术属于医药
，涉及到单克隆抗体纯化技术，具体涉及到一种无糖基化抗PD-1单克隆抗体的纯化方法。
技术介绍
PD-1是一种免疫抑制剂性受体，主要在激活的T细胞及B细胞中，功能是抑制细胞激活，在免疫应答中发挥负调控作用，PD-1的配体PDL-1与PDL-2高表达于肿瘤微环境中，导致肿瘤微环境PD-1通路持续激活，T细胞功能被抑制，无法杀伤肿瘤细胞；同时PD-1的信号传导可以抑制B细胞增殖、分化Ig类型转换，在建立和维护外周自身耐受中起重要作用。抗PD-1单抗是针对PD-1的一种抗体蛋白，该抗体能特异性地与PD-1结合，阻断PDL-1与PD-1相结合部分，恢复T细胞功能，对肿瘤生长具有显著抑制作用，在治疗肿瘤方面具有很好的靶向潜能。针对这一优势，开发研制了一种重组人源化抗PD-1单克隆抗体，其上糖基化修饰被敲除。过去多年的抗体研究都强调糖基化对抗体功能的重要性，但带糖基化的抗体免疫原性和蛋白折叠凳也会存在很多不确定性，增加了工艺开发的难度。目前部分研究者发现无糖基化后的抗体开发比较稳定，均一性提高，且能降低抗体在体内引起的炎症及细胞毒性，同时抗体的Fc片段更灵活，更易与FcyRs结合。然而构建的无糖基化的抗PD-1单克隆抗体由于去除糖基化而对胰蛋白酶等的敏感性显著增加，结构灵活性增强，在低pH情况下更容易有聚体形成的趋势，易聚集沉淀，急需一种纯化方法来解决蛋白聚集问题。从重组表达的宿主中提取单克隆抗体，柱层析是关键。结合在柱上的蛋白可以通过调节流动相的类型、pH和浓度来被洗脱下来，在这些过程中，存在蛋白浓度或表面密度过高的情况，从而导致聚体形成以及蛋白的异质性。层析中的亲和层析通常有很高的配基密度高，更易在柱表面或柱上部形成高蛋白密度，且亲和层析通常用于粗纯对回收率要求较高，洗脱pH较低，蛋白易沉淀，更易产生聚体，故更需在纯化过程中减少聚体的产生，提高蛋白稳定性。抗体纯化过程中病毒灭活多采用低pH病毒灭活，在低pH条件下，目的蛋白容易产生聚体，这些聚体的产生大大威胁了抗体的稳定性，对临床用药也存在潜在威胁，因此很有必要提供一种抗体纯化方法来减少这些聚体的产生。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供了一种可有效减少聚体产生的无糖基化抗PD-1单克隆抗体的纯化方法，该方法可有效减少聚体产生，提高抗PD-1单抗的稳定性和回收率。本专利技术的技术方案如下：一种无糖基化抗PD-1单克隆抗体的纯化方法，包括亲和层析和病毒灭活步骤。优选地，该方法具体包括如下步骤：(1)对细胞培养液上清进行亲和层析：平衡、上样、洗涤、洗脱过程；(2)收集步骤(1)洗脱流出液加入糖类物质，搅拌至完全溶解；(3)将步骤(2)所得样品调pH进行低pH病毒灭活。优选地，所述步骤(1)中亲和层析过程，平衡过程采用缓冲液平衡，缓冲液为含盐的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液(0.02mol/L，pH7.0～7.4)；洗涤过程包括三步，第一步平衡缓冲液复平衡，第二步所用的洗涤缓冲液为含盐的Tris-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH8.0～8.5)；第三步洗涤所用的洗涤缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH4.5～5.5)；洗脱缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH2.7～3.1)。优选地，所述的盐为氯化钠，氯化钾或氯化铵中的一种，平衡液所述含盐浓度为0.15mol/L，第二步洗涤所述含盐浓度为0.15～0.5mol/L。优选地，步骤(2)所述的糖类物质选自蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨醇中的一种，优选蔗糖。优选地，糖类物质的质量与步骤(1)洗脱流出液样品的质量体积比为0.02～0.08:1，其中质量以g计，体积以ml计。优选地，步骤(3)的操作过程是采用pH调节剂调节pH3.5～3.9，灭活1h，然后再调节至pH6.0～7.0，其中pH调节剂为0.1～1mol/L柠檬酸或磷酸氢二钠。另外，亲和层析过程，甘氨酸-盐酸缓冲液还可以是组氨酸-盐酸缓冲液。为了得到更高纯度的抗PD-1单抗，在亲和层析和病毒灭活后可进行离子交换层析、超滤等步骤，经过此进一步纯化后，聚体可减少到0.3％以下。本专利技术所述的细胞培养液是CHO细胞培养液，需要对其进行深层过滤，深层过滤滤膜和条件不做限制，只要能够得到满足下一步亲和层析的滤出液即可。本专利技术不对亲和层析填料进行限制，可以是MabselectsureLX，也可以是Mabselectsure、ProteinA等填料。本专利技术在亲和层析过程中，引入盐成分，能够显著地改善亲和层析性能，降低蛋白浊度。洗涤和洗脱过程引入甘氨酸-盐酸缓冲液，甘氨酸作为氨基酸，可以作为蛋白保护剂，在低pH洗涤洗脱条件下，可有效减少聚体产生，增加蛋白稳定性。在病毒灭活过程中，加入了糖类物质，可以减少聚体形成，使抗体在低pH灭活下聚体增加变缓；另外所加入的糖类物质本身就是药用辅料，增大了药用安全性。本专利技术很好的减少了无糖基化抗PD-1单克隆抗体纯化过程中聚体的形成，保护了蛋白的稳定性。本专利技术操作简单，方便易行，安全性高，可使得抗PD-1单抗的纯度达到97％以上，浊度降低到60NTU以下，收率提高到99％以上，且成本低廉，可用于工业化大规模生产。具体实施方式为了更好的理解本专利技术的内容，下面通过具体的实施例来进一步说明本专利技术的技术方案，但这些实施例并不限制本专利技术。实施例中所用的原料与耗材均可通过商业途径或公知方法制备获得。本专利技术实施例中所使用的样品是抗PD-1单克隆抗体是体外哺乳动物细胞发酵表达而得到，动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，单克隆抗体为IgG1类型，其FC片断的三个糖基化位点发生突变。本专利技术中样品为细胞培养液需通过深层过滤后得到的。以下实施例亲和层析柱为XK16柱，购自GE公司，填料为：MabselectsureLX；样品为：通过深层过滤后的细胞培养液上清，其蛋白表达量为4.2g/L，以下实施例亲和层析上柱样品蛋白量为1500mg。柱子载样量为50g/L。CV为30mL，CV表示柱体积。实施例1亲和层析：(1)平衡：用含氯化钠0.15mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.02mol/L，pH7.0)平衡层析柱5CV，流速10ml/min；(2)上样：将上述样品进行上样，使抗体蛋白吸附到亲和层析柱上，流速5.6ml/min；(3)洗涤：上样结束后先用上述平衡缓冲液进行复平衡3CV，流速5.6ml/min，然后用含0.15mol/L氯化钠的Tris-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH8.0)洗涤5CV；再用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH4.5)洗涤3CV，流速10ml/min；(4)洗脱：用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH2.7)进行洗脱，流速10ml/min，收集洗脱流出液至基线平稳，共100mL，取样检测。病毒灭活：向步骤(4)收集的流出液加入5g蔗糖，搅拌至完全溶解，用0.5mol/L的柠檬酸调节pH至3.5灭活1h，再用1mol/L的磷酸氢二钠调pH至6.0，取样检测。各步骤中取样检测结果见表1。表1实施例1各步骤检测结果实施例2亲和层析：(1)平衡：用含氯化钾0.15mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无糖基化抗PD‑1单克隆抗体的纯化方法，包括亲和层析和病毒灭活步骤，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)对细胞培养液上清进行亲和层析：平衡、上样、洗涤、洗脱过程；(2)收集上述洗脱流出液加入糖类物质，搅拌至完全溶解；(3)将步骤(2)所得样品调pH进行低pH病毒灭活。

【技术特征摘要】
1.一种无糖基化抗PD-1单克隆抗体的纯化方法，包括亲和层析和病毒灭活步骤，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)对细胞培养液上清进行亲和层析：平衡、上样、洗涤、洗脱过程；(2)收集上述洗脱流出液加入糖类物质，搅拌至完全溶解；(3)将步骤(2)所得样品调pH进行低pH病毒灭活。2.根据权利要求1所述的一种无糖基化抗PD-1单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述平衡过程为缓冲液平衡，所述的缓冲液为pH7.0～7.4含盐的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液。3.根据权利要求1所述的一种无糖基化抗PD-1单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述洗涤过程包括三步，首先用平衡缓冲液复平衡，然后用pH8.0～8.5含盐的Tris-盐酸缓冲液进行洗涤，再用pH4.5～5.5甘氨酸-盐酸缓冲液进行洗涤。4.根据权利要求1所述的一种无糖基化抗PD-1单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，步骤(1)洗脱过程为缓冲液洗脱，所述的缓冲液为pH2.7～3.1甘氨酸-盐酸缓冲液。5.根据权利要求2-3任一项所述的一种无糖基化抗PD-1单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述的盐为氯化钠、氯...

【专利技术属性】
技术研发人员：张贵民，赵丽丽，刘增田，
申请(专利权)人：鲁南制药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37