抗肿瘤干细胞标志蛋白CD133的单域抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种抗肿瘤干细胞标志蛋白CD133的单域抗体及其应用。本发明专利技术从人源单域抗体文库，利用噬菌体展示技术筛选与CD133胞外段结合的抗体，最终筛选出2个单域抗体，分别命名为HW‑145和HW‑314。将这2个单域抗体基因扩增，测序，并克隆至表达载体，进行单域抗体原核系统表达纯化，随后进行ELISA检测、MTT、细胞凋亡、Transwell侵袭实验，结果显示2个单域抗体与抗原结合能力较强，能有效的抑制肿瘤细胞增殖、侵袭，并能够诱导肿瘤细胞凋亡。本发明专利技术所提供的抗体为全人源化单域抗体，应用在人体内不会产生免疫原性，且在体外具有抑制肿瘤细胞的作用。这2个单域抗体为后期开发肿瘤抗体药物奠定基础。

Single Domain Antibody Against Tumor Stem Cell Marker Protein CD133 and Its Application

【技术实现步骤摘要】
抗肿瘤干细胞标志蛋白CD133的单域抗体及其应用
本专利技术涉及抗体领域，特别涉及一种抗肿瘤干细胞标志蛋白CD133的单域抗体及其应用。
技术介绍
肿瘤细胞具有的不死性、迁移性和失去接触抑制的特点，使得肿瘤成为人类极难治愈的疾病之一。目前肿瘤治疗手段主要有手术切除，放疗或者化疗，但在肿瘤中的存在一群具有类似干细胞特性的肿瘤干细胞导致治疗后肿瘤复发率极高。2006年，美国癌症研究协会将肿瘤干细胞定义为：肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。这种细胞在体内可以长期处于休眠状态，并具有多种耐药分子而对杀伤肿瘤细胞的外界理化因素不敏感，导致在常规肿瘤治疗方法消灭大部分普通肿瘤细胞后，肿瘤再次复发。基于肿瘤干细胞的特性，通过基因工程技术开发靶向肿瘤干细胞表面特异性标记分子的抗体，或许将成为治疗癌症的新曙光。作为干细胞及肿瘤干细胞表面特异性标记蛋白之一，CD133最早是Yin等从CD34造血干细胞中通过人工AC133单克隆抗体分离而来。CDl33属于Prominin家族成员之一，基因定于位于人的4号染色体，大小约152kb，包含至少37个外显子。CD133蛋白由865个氨基酸组成，分子量约120kDa，包含：细胞外NH2-端，5次跨膜结构域，2个胞外环状结构，2个富含半胱氨酸的胞内环状结构，胞内-COOH结构。已有研究表明，CD133是一种造血干细胞和神经干细胞的表面标志物；在脑胶质瘤、结肠癌、恶性黑色素瘤等肿瘤的肿瘤干细胞中CD133均有表达，并且在脑肿瘤、乳腺癌和结肠癌中，CD133+细胞比CD133-细胞成瘤性强；通过基因芯片和临床分析发现，CDl33+肿瘤细胞表现出更强的增殖能力，并且预后较差。以上研究结果均表明，CDl33在肿瘤干细胞中的表达对癌症的发展具有重要意义。因此，可将CD133作为开发抗肿瘤药物的新靶点。与传统的单克隆抗体相比，仅由一个重链可变区组成的单域抗体具有分子量小，易于穿过血脑屏障，免疫原性低，特异性强等优点。已有相关研究结果表明，单域抗体可有效的靶向抗原，且在体内外均具有抗肿瘤效果。目前，还没有关于抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133单域抗体的研究。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133的单域抗体。本专利技术的另一目的在于提供所述抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133的单域抗体的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133的单域抗体，由1个重链可变区组成，为氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的命名为HW-145的抗体或氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的命名为HW-314的抗体。HW-145抗体：QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGDTVSNHDMAWVRQAPGKGLEWVSSINSKDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWSKSQHSEMSYWGQGTLVTVSS；HW-314抗体：QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRISPEVMAWVRQAPGKGLEWVSTIKTADGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASVKHQVPEHFNFWGQGTLVTVSS。编码所述的抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133的单域抗体的核苷酸序列如下：编码命名为HW-145的抗体的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；编码命名为HW-314的抗体的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。编码HW-145抗体的核苷酸序列：CAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGAGACACCGTTTCCAATCACGACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTATCAATGATTAATATGAAGGACGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGCGCTGGTCCAAGTCCCAGCACTCCGAGATGTCCTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC；编码HW-314抗体的核苷酸序列：CAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTTCGTATTTCCCCTGAGGTTATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTATCAACCATTAAGACGGCAGACGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGAGTGTTAAGCACCAGGTGCCTGAGCACTTTAATTTTTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC。编码HW-145抗体和HW-314抗体的核苷酸序列均由360个碱基组成，编码120个氨基酸。含有3个CDR(互补决定簇)区：CDR1含有9个氨基酸；CDR2含有6个氨基酸；CDR3含有12个氨基酸。所述的抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133的单域抗体可通过将编码所述的抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133的单域抗体的核苷酸序列克隆至表达载体中，构建重组表达质粒，再将重组表达质粒转入宿主细胞进行抗体蛋白表达、纯化，即可得到所述抗CD133单域抗体。所述的抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133的单域抗体在制备抗肿瘤抗体药物中的应用。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术以噬菌体展示技术为基础，从人源单域抗体噬菌体文库筛选出2个与CD133胞外段结合的抗CD133单域抗体，仅通过原核系统就可进行抗体表达，可大幅度简化生产工艺，降低抗体生产成本，且本抗体无需使用抗原免疫人体就可获得。(2)本专利技术所提供的抗CD133单域抗体仅由一个重链可变区结构域组成，具有分子量小，组织渗透性强，结构稳定等优点。(3)本专利技术所提供的人源性单域抗体应用于人体内不会产生免疫原性，可用于将来开发肿瘤抗体药物。附图说明图1是通过ELISA检测2个纯化的抗CD133单域抗体与CD133胞外段结合的结果图；其中，BSA为空白对照，HER2和EGFR为无关抗原对照，CD133为相关抗原，以2个单域抗体分别作为一抗，以HRP-proteinA作为二抗，进行ELISA检测。图2是通过MTT方法检测单域抗体对肿瘤细胞增殖能力影响的结果图；其中，使用2个抗体(HW-145和HW-314)在不同的浓度(0，25，50，100μg/mL)下培养肿瘤细胞DU145(图A)、MCF-7(图B)，72h后每孔加入30μL的MTT孵育4h，再加入200μL的DMSO使甲瓒充分溶解，之后用酶标仪本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133的单域抗体，其特征在于：由1个重链可变区组成，为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的命名为HW‑145的抗体或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的命名为HW‑314的抗体。

【技术特征摘要】
1.一种抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133的单域抗体，其特征在于：由1个重链可变区组成，为氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的命名为HW-145的抗体或氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的命名为HW-314的抗体。2.编码权利要求1所述的抗肿瘤干细胞标记蛋白CD133的单域抗体的核苷酸序列，其特征在于：编码所述的命名为HW-145的抗体的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；编码所述的命名为HW-314的抗体的核苷酸序列如SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏星，刘志芳，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44