一种禽腺病毒fiber蛋白亚单位疫苗制造技术

本发明专利技术提供一种禽腺病毒fiber蛋白亚单位疫苗，是使用禽腺病毒新型的抗原fiber蛋白，对序列进行优化后使fiber蛋白在大肠杆菌中获得可溶性的表达，表达产物制备亚单位疫苗，其中禽腺病毒fiber抗原蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。本发明专利技术的禽腺病毒fiber蛋白制备的亚单位疫苗具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，不产生其他不相关抗体，检测方法方便准确的特点，为工业化生产禽腺病毒亚单位疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。

A fiber protein subunit vaccine of avian adenovirus

【技术实现步骤摘要】
一种禽腺病毒fiber蛋白亚单位疫苗
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种禽腺病毒fiber蛋白亚单位疫苗。
技术介绍
禽腺病毒(FowlAdenovirus，FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，分为5个种(A～E)，12个血清型；禽腺病毒FAdV在世界各地均有报道。FAdV感染一般引起亚临床状况，而急性感染主要引起包涵体肝炎、心包积液以及肌胃糜烂等。自2013年，国内鸡群由FAdV引起的包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多。到2015年，FAdV感染在国内多个省份鸡群爆发。目前FAdV爆发不仅发生在3～4周龄肉鸡，还发生于10～20周龄的蛋鸡，给国内养鸡业造成了严重经济损失。禽腺病毒是无包膜的球型结构，衣壳为20面体立体对称，由252个壳粒组成，其中240个为六邻体(Hexon,120KD)，为主要的包膜蛋白；12个顶角的壳粒称为五邻体(Penton,82KD)；还有三聚体蛋白的纤维(62KD)。其中五邻体基底一端通过非共价键与三聚体纤维相连,另一端吸附到细胞膜上。其中病毒fiber是主要的免疫蛋白，能有效地保护鸡免受FAdV的感染。现有的禽腺病毒疫苗是使用完整的病原体作为制苗用抗原，但目前制造疫苗使用的毒株与临床流行毒株的抗原性存在较大的差异，从而影响了攻毒保护效果，制约灭活疫苗的应用。而且弱毒苗的效力很容易受母源抗体和抗生素的干扰，且弱毒菌株存在毒力返强以及诱导隐性感染的可能性。因此，针对禽腺病毒免疫保护性抗原研制亚单位疫苗，是禽腺病毒新型亚疫苗研究的主要方向。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种禽腺病毒fiber蛋白亚单位疫苗，是使用一种禽腺病毒新型的抗原fiber蛋白，对序列进行优化后使fiber蛋白在大肠杆菌中获得可溶性的表达，表达产物制备亚单位疫苗，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一种禽腺病毒fiber抗原蛋白，包含有：1)氨基酸序列为SEQIDNO:2的蛋白；2)在1)的蛋白上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白功能的蛋白；编码上述禽腺病毒fiber蛋白的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:1；本专利技术还提供上述fiber抗原蛋白的优化体，其氨基酸序列为SEQIDNO:4，其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO:3；本专利技术的禽腺病毒fiber蛋白可用于制备疫苗或诊断试剂。本专利技术再一个方面提供一种亚单位疫苗，是使用上述的fiber蛋白作为抗原制备的。本专利技术的禽腺病毒fiber蛋白制备的亚单位疫苗具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，不产生其他不相关抗体，检测方法方便准确的特点，为工业化生产禽腺病毒亚单位疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细的描述。本专利技术所应用的方法可以采用疫苗制备领域中常用的方法，而不仅限于本专利技术实施例的具体记载，本领域的普通技术人员可以其它常规方法来实现本专利技术。实施例1：fiber基因的扩增及序列分析将2017年在山东烟台某养鸡场发生疑似心包积液综合征，经临床调查和实验室检测，初步诊断为禽腺病毒感染。经调查，确信上述的发病鸡群之前已经注射过禽腺病毒疫苗。怀疑有禽腺病毒病毒在疫苗的选择压力下发生了突变，从发病鸡的肝脏中成功分离出病毒，作为扩增的模板。1、扩增禽腺病毒fiber基因根据NCBI中发表的禽腺病毒fiber基因序列，设计并合成了引物，引物的序列信息如下：primer1：5′-ATGCTCCGAGCCCCTAAAAG-3′；primer2：5′-TTACGGGAGGGAGCCCGCTG-3′。分离的禽腺病毒核酸作为模板，用引物primer1和primer2进行PCR扩增目的片段，经序列测定，其核苷酸序列为SEQIDNO:1，根据测序结果推导其氨基酸序列为SEQIDNO:2。与NCBI中已公布的禽腺病毒fiber蛋白(AOS50917.1)进行比对分析，结果氨基酸同源性约为97％，有多个位点发生了变异，第40位(K变M)，第219位(D变E)，第272位(T变S)，第291位的(P变A)，第295位(T变R)，第299位(T变M)，第300位(T变R)，第405位(S变R)，第406位(I变A)，第421位(N变K)，第439位(E变Q)，第453位的(A变T)，第459位(N变K)。结果表明分离的毒株为发生变异的禽腺病毒，其含有新的fiber基因。2、fiber基因的剪切、优化将分离毒株的结构蛋白基因fiber的抗原位点进行了分析，将其N端180aa删除，留下fiber的球形结构域和少量杆状把柄，既能完整地表达fiber蛋白的免疫位点，又能形成很好的空间结构。同时将密码子进行优化，提高蛋白的表达效率。优化修饰后的氨基酸序列分别为SEQIDNO:4。优化修饰后的序列为能很好地表达出抗原位点。将选取的基因进行了密码子优化，优化后的基因的核苷酸序列为SEQIDNO:3。实施例2、表达fiber基因重组质粒的构建2.1酶切反应2.1.1标记好需要用到的1.5mLEP管，在1.5mLEP管中按照下表进行加样、混匀：反应体系为50μL，加样如下所示：2.1.2将步骤2.2.1中的1.5mLEP管置于37℃恒温水浴锅中，水浴2-3h。2.1.3双酶切产物胶回收取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段。(1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管。(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值。(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中。(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μLPCbuffer50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL平衡液BL，离心12,000rpm，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置2min，10,000rpm，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2放入收集管中。(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PWbuffer，静置3min，离心10,000rpm，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。(8)重复步骤(7)。(9)空吸附柱离心，12,000rpm，2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干。(10)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μLElutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm，2min。(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱CB2，盖上离心管盖子，保留离心管中的DNA样品。(12)将步骤11中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收DNA片段。2.2连接反应(1)标记需要用到的0.2mL离心管。(2)在标记完整的0.2mL管中按照下表的20μL反应体系进行加样：(3)完成加样后，用移液器轻轻吹打几次混匀各组分。(4)将0.2mL离心管置于37℃反应30min，待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。(5)步骤(4)的反应产物可直接进行转化实验，也可储存于-20℃，待需要解冻本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种禽腺病毒fiber抗原蛋白，其特征在于，所述的fiber抗原蛋白包含有：1)氨基酸序列为SEQ ID NO:2的蛋白；2)在1)的蛋白上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白功能的蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种禽腺病毒fiber抗原蛋白，其特征在于，所述的fiber抗原蛋白包含有：1)氨基酸序列为SEQIDNO:2的蛋白；2)在1)的蛋白上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白功能的蛋白。2.如权利要求1所述的禽腺病毒fiber抗原蛋白，其特征在于，所述的fiber抗原蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:4。3.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1或2所述的禽腺病毒fiber抗原蛋白。4.如权利要求3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭伟伟，向银辉，窦小龙，范根成，杜元钊，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37