一种预防4型禽腺病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种预防4型禽腺病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用，属于兽用生物制品领域。本发明专利技术克隆、扩增FAdV 4C Hexon基因的C‑端和N‑端结构域基因；利用昆虫细胞‑杆状病毒双向表达系统构建能够共表达两种抗原蛋白的重组杆状病毒rBac‑HEXON‑P10‑C‑PH‑N，该重组病毒在昆虫细胞HF中高效表达FAdV 4C Hexon‑C与Hexon‑N抗原蛋白；经过提取纯化、BEI灭活后加入佐剂乳化制成疫苗。所述制备方法简单，能同时大量制备FAdV 4C Hexon‑C与Hexon‑N两种蛋白，耗时短，表达量高，大大节约了生产成本，适合大规模生产。所得重组亚单位疫苗，免疫效果良好，免疫剂量小并能有效预防禽腺病毒的感染。

A subtype vaccine against avian adenovirus type 4 and its preparation method and Application

The invention discloses a type 4 avian adenovirus subunit vaccine, a preparation method and application thereof, belonging to the field of veterinary biological products. The invention clones and amplifies the C_and N_terminal domain genes of the FAdV 4C Hexon gene, and constructs a recombinant baculovirus rBac_HEXON_P10_C_PH_N which can co-express two antigen proteins using an insect cell_baculovirus bidirectional expression system, and the recombinant virus efficiently expresses FAdV 4C Hexon_C and He_N in insect cell HF. Xon N antigen protein was extracted and purified, and BEI was inactivated and then added with adjuvant to emulsify the vaccine. The preparation method is simple, and the two proteins FAdV 4C Hexon_C and Hexon_N can be prepared simultaneously in large quantities. The method has the advantages of short time-consuming, high expression, greatly saving production cost and is suitable for large-scale production. The recombinant subunit vaccine has good immune effect, low immune dose and can effectively prevent avian adenovirus infection.

【技术实现步骤摘要】
一种预防4型禽腺病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种预防4型禽腺病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用，属于兽用生物制品领域。
技术介绍
禽腺病毒(Fowladenovirus，FAdV)可分为3个群，Ⅰ群比较著名的病毒株包括鸡胚致死孤儿病毒、鹌鹑支气管炎病毒和鸡包涵体肝炎病毒，Ⅱ群禽腺病毒包括火鸡出血性肠炎病毒、大理石脾病毒和鸡大脾病毒，Ⅲ群禽腺病毒只包括减蛋综合征病毒。Ⅰ群腺病毒可分为12个血清型，从高发病地区血清分析看，主要为C(血清4型)和E(血清8型)，安卡拉病(心包积水-肝炎综合征)就是由血清4型引起的，该病多发于肉鸡，近期也开始感染麻鸡以及产蛋鸡的育成鸡，并且育成鸡发病死亡率非常高。I群禽腺病毒对外界环境具有很强的抵抗力，不仅能通过种蛋垂直传播给子代，还能通过污染的粪便、水槽以及种蛋进行水平传播，这就在临床上增加了其防控难度。虽然国内外有相关疫苗研制的很多报道，如灭活疫苗、减毒活疫苗及新兴起的基因工程疫苗，均能提供不同程度的免疫保护，但是目前仍然没有达到非常理想的治疗效果，而不同的血清型之间的同源性的差异，更增加了疫苗研制的难度。然而疫苗接种仍然是预防、控制甚至消灭禽腺病毒的主要措施之一。目前对禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白(Hexon)的功能已进行了很多研究，该蛋白带有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇，能引起极强的中和反应，当其被替代或突变将会导致中和免疫的缺失。该蛋白拥有两个主要功能区，保守基部区P1和P2，以及可变结构环L1-L4。Hexon蛋白前段氨基酸(N端)为可变结构环L1和基部区P1，其中几个比较大的抗原表位区都位于前段和中段，但疏水性氨基酸残基较多且暴露性差，它们整体分布在病毒颗粒的表面，是病毒引起宿主免疫应答的重要保护性抗原决定簇，是Hexon的结构域。重组亚单位疫苗不含有核酸物质，安全性较好，接种后不会产生持续感染或潜伏感染，产生的免疫应答可以与野毒感染相区分，有利于疫病的控制和消灭。因此，研制一种生产成本低、生产效率高以及疫苗免疫效果好的禽腺病毒重组亚单位疫苗的生产方法具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种包含FAdV4CHexon蛋白的C-端和N-端两种抗原蛋白的重组亚单位疫苗。所提供的疫苗具有高效、安全性好、抗体整齐度高、保护率高的优点，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一种抗原蛋白，包括Ⅰ群4型禽腺病毒FAdV4CHexon蛋白的C-端和N-端的结构域。所述C-端的结构域的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。所述N-端的结构域的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术还提供制备所述C-端和N-端的结构域的方法，包括下述步骤：(1)扩增编码C端、N端结构域的基因：在C-端引物两端分别添加XhoI和SphI酶切位点，而N-端引物两端分别添加BamHI和HindⅢ酶切位点，分别可扩增出C-端结构域序列(SEQIDNO.2)，以及N-端结构域序列(SEQIDNO.4)；(2)构建中转质粒：将pFastBacDual和C-端结构域基因片段用XhoI和SphI酶切后分别回收、纯化，连接过夜；将连接产物在无菌条件下转化T1感受态细胞中，筛选得到重组质粒，命名为pFastBacDual-HEXON-P10-C；(3)目的基因与重组中转质粒连接：将上述构建完成的pFastBacDual-HEXON-P10-C和Hexon基因的N-端结构域基因片段用BamHI和HindⅢ酶切后分别回收、纯化，连接过夜；(4)连接产物转化感受态细胞：将连接产物在无菌条件下转化T1感受态细胞中，筛选得到重组质粒，命名为pFastBacDual-HEXON-P10-C-PH-N；(5)构建重组杆状病毒：将质粒pFastBacDual-HEXON-P10-C-PH-N转入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，筛选得到重组杆粒，命名为rBacmid-HEXON-P10-C-PH-N；(6)重组杆粒转染sf9细胞：将提纯的重组杆粒用脂质体转染的方法将重组杆粒转染sf9细胞，获得F1代重组杆状病毒rBac-HEXON-P10-C-PH-N；(7)重组Hexon蛋白的C-端和N-端结构域蛋白的大量表达：将鉴定正确的重组病毒以MOI＝1～10的接毒量接种HF细胞大量培养，离心收集培养液上清，即获得含有大量的重组Hexon蛋白的C-端和N-端结构域蛋白。所述重组Hexon蛋白的C-端和N-端结构域蛋白的进一步纯化方法：利用镍柱(HisTrapHP，5mL)对重组蛋白进行纯化，并对纯化后的重组蛋白进行透析处理，去除纯化样品中的咪唑和氯化钠。本专利技术还提供用于预防Ⅰ群4型禽腺病毒的重组亚单位疫苗，包括Ⅰ群4型禽腺病毒FAdV4CHexon蛋白的C-端和N-端结构域蛋白和疫苗佐剂。所述疫苗中抗原区蛋白的含量在75～100μg/mL之间。所述疫苗中的佐剂：道达尔170白油佐剂，能使疫苗中的抗原物质缓慢释放，从而延长疫苗的作用时间。本专利技术将表达的禽腺病毒Hexon蛋白的C端和N端结构域蛋白的重组杆状病毒rBac-Hexon-P10-C-PH-N，接入昆虫细胞高效的表达Hexon蛋白的C端和N端结构域蛋白，经过离心去除细胞碎片，加入BEI灭活后，加入油佐剂混合乳化制成疫苗。本专利技术制备的疫苗能提高免疫后的抗体水平，提高免疫后抗体的整齐度，保证疫苗的免疫效果，此疫苗具有高效、安全性好的优点且具有良好的免疫保护作用。附图说明图1是Hexon蛋白的C-端结构域基因序列的PCR扩增；M：DL5000DNAMarker；1：Hexon-CPCR产物。图2是Hexon蛋白的N-端结构域基因序列的PCR扩增；M：DL5000DNAMarker；1～3:7Hexon-NPCR产物。图3是转移载体构建PCR鉴定；M：DL5000DNAMarker；1～11:11个不同菌落C端鉴定PCR，12-22：11个不同菌落N端鉴定PCR。图4是重组杆粒PCR鉴定；M：DL5000DNAMarker；1:转座鉴定。图5是SDS-PAGE检测重组杆状病毒表达产物；M：预染蛋白质Marker；1：sf9细胞；2：感染空杆状病毒的Sf9细胞；3：F3代重组杆状病毒。图6是WesternBlot鉴定重组杆状病毒表达产物；M：预染蛋白质Marker；1：sf9细胞；2：感染空杆状病毒的Sf9细胞；3：F3代重组杆状病毒。具体实施方式实施例1：重组杆状病毒的构建1、禽腺病毒基因组提取：用传统方法提取Ⅰ群4型禽腺病毒SD株总DNA；2、引物设计与合成：以自行分离的Ⅰ群4型禽腺病毒SD株基因组为模板分析FAVⅠhexon基因编码的蛋白抗原性、亲水性和表面展示概率，选取N端494个氨基酸以及C端239个氨基酸两个结构域，进行杆状病毒真核表达。根据GenBank已发表的禽腺病毒Hexon基因的C-端和N-端结构域基因序列分别设计一对特异性引物，并在C-端引物两端分别添加XhoI和SphI酶切位点，而N-端两端分别添加BamHI和HindⅢ酶切位点，分别可扩增出C-端序列717bp的目的片段(SEQIDNO.2)，以及N-端序列1485bp的目的片段(SEQIDNO.4)。引物序列分别为：P1:CGCCTCGAGAA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗原蛋白，其特征在于，包括Ⅰ群4型禽腺病毒FAdV 4C Hexon蛋白的C‑端和N‑端的结构域；所述C‑端的结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述N‑端的结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种抗原蛋白，其特征在于，包括Ⅰ群4型禽腺病毒FAdV4CHexon蛋白的C-端和N-端的结构域；所述C-端的结构域的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；所述N-端的结构域的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。2.编码权利要求1所述抗原蛋白的基因。3.制备权利要求1所述抗原蛋白的方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)扩增编码C端、N端结构域的基因：在C-端引物两端分别添加XhoI和SphI酶切位点，而N-端引物两端分别添加BamHI和HindⅢ酶切位点，分别可扩增出C-端结构域序列，以及N-端结构域序列；(2)构建中转质粒：将pFastBacDual和C-端结构域基因片段用XhoI和SphI酶切后分别回收、纯化，连接过夜；将连接产物在无菌条件下转化T1感受态细胞中，筛选得到重组质粒，命名为pFastBacDual-HEXON-P10-C；(3)目的基因与重组中转质粒连接：将上述构建完成的pFastBacDual-HEXON-P10-C和Hexon基因的N-端结构域基因片段用BamHI和HindⅢ酶切后分别回收、纯化，连接过夜；(4)连接产物转化感受态细胞：将连接产物在无菌条件下转化T1感受态细胞中，筛选得到重组质粒，命名为pFastBacDual-HEXON-P10-C-PH-N；(5)构建重组杆状病毒：将质粒pFastBacDual-HEXON-P10-C-PH-N转入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，筛选得到重组杆粒，命名为rBacmid-HEXON-P1...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶正琴，范娟，钱钟，丁国伟，潘杰，李玉和，宋庆庆，杨振，董昌海，李玉安，
申请(专利权)人：扬州优邦生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32