Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白、其制备方法及应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了Ι群4型禽腺病毒具有免疫保护功能的亚单位蛋白，其为Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白球形区截短体蛋白，从氨基酸283位到氨基酸479位的抗原决定簇氨基酸序列，具有较好的抗原性和免疫原性。该Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白及药学上可以接受佐剂制成疫苗，该疫苗制备方法主要包括先将密码子优化后的Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白球形区截短体蛋白核苷酸序列克隆到载体中，再将重组载体转化、诱导表达、纯化后得到抗原蛋白，最后将抗原蛋白与佐剂乳化后得到疫苗。该疫苗安全、有效；且制备该亚单位疫苗的方法简单、成本低、易于放大。

Group 4 avian adenovirus subunit protein, preparation method and application thereof

The present invention belongs to the field of biological technology. The subunit protein of the 4 avian adenovirus with immune protection function is disclosed. It is the globular region truncated protein of avian adenovirus type 4 type of avian adenovirus, which determines the amino acid sequence from the amino acid 283 to the amino acid 479. It has good antigenicity and immunogenicity. The vaccine of the 4 avian adenovirus subunit protein and the pharmaceutically acceptable adjuvant is mainly prepared by cloning the nucleotide sequence of the globular region truncated protein nucleotide sequence of the avian adenovirus type 4 avian adenovirus, which was optimized by the codon, and then the recombinant carrier was transformed, induced, and purified. The antigen protein was then emulsified with the adjuvant to obtain the vaccine. The vaccine is safe and effective, and the preparation of the subunit vaccine is simple, low cost and easy to scale up.

【技术实现步骤摘要】
Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白、其制备方法及应用
本专利技术属于生物制品
，具体涉及一种Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白、其制备方法及其用于制备疫苗的应用。
技术介绍
禽腺病毒(Fowladenovirus，FAdV)是禽类常见的传染性病原，多数在禽体内复制却不致病或只是引起轻微的病症。但是当有其它诱因或是发生混合感染时，也会影响禽群健康。某些禽腺病毒本身具有致病性，如火鸡出血性肠炎病毒(Hemorrhagicenteritisvirus，HEV)、鹌鹑支气管炎病毒(Quilbronchitisvirus，QBV)、产蛋下降综合征病毒(Eggdropsyndromevirus，EDSV)等。多数禽腺病毒可在禽的肝或肾细胞上增殖。根据血清型差异将其分为三个亚群：来源于鸡、火鸡、鹅的多数禽腺病毒属于I群，如，禽7型腺病毒(FAdV-7)、禽10型腺病毒(FAdV-10)、包涵体性肝炎病毒(Inclusionbodyhepatitis，IBH)等，代表种为FAdV-1；HEV为禽腺病毒II群；而EDSV与禽腺病毒I群没有共同的型特异性抗原，在分子水平上也与I群存在实质性的差异而被归为禽腺病毒Ⅲ群。I群禽腺病毒呈世界性分布，各日龄段家禽均易感。可以通过水平和垂直两种途径传播。虽然感染鸡的12个血清型之间及血清型内部的毒力各有不同，但12个血清型均能诱发包涵体肝炎(IBH)。该病在我国鸡群中发病率较高，且呈逐年上升趋势。发病的宿主范围越来越广，白羽肉鸡、肉种鸡、蛋鸡、黄羽鸡均可感染发病。特别是2010年以后发病呈现增加趋势，在全国范围内均有流行。I群禽腺病毒的发病给饲养业造成了严重的经济损失。2015年以来，我国多地区鸡群暴发由I群FAdV引起的心包积液综合征和鸡包涵体肝炎疫情，从高发地区血清型和临床症状看，主要为FAdV-4型。FAdV-4引起的心包积水肝炎综合征(HHS)的主要临床症状为产蛋下降和引起死亡(死亡率在20％～80％)，主要病理变化是心包腔中有淡黄色清亮的积液，肝脏肿大、苍白，肾脏肿大，肝脏出现多发性局灶性坏死，肝细胞中见核内包涵体。I群禽腺病毒为二十面体对称，包括240个六邻体和12个五邻体。五邻体由两种蛋白构成，一个锚定在衣壳上的五邻体基体蛋白(penton)和一个伸向外侧的纤细的纤突蛋白(fiber)。但是，I群禽腺病毒的五邻体呈现出一种不同的形态特征，即每个五聚基体连有两个纤突(如图1所示)，分为长纤突蛋白(fiber-1)和短纤突蛋白(fiber-2)，两纤突受体结合部基因序列不同，可能与受体结合相关。纤突蛋白可分为尾(tail)、杆(shaf)及球形区(knob)3部分，尾区与五邻体基底相连；杆端一般由22个重复亚单位构成，球形区为功能区，可与宿主细胞受体结合，纤维蛋白具有型和亚群特异性抗原决定簇，能诱导产生保护性抗体。目前，主要使用FAdV-4接种鸡胚、原代鸡肾脏细胞或鸡胚肝癌细胞来制备疫苗。鸡胚繁殖病毒含量低；而原代肝肾细胞制备繁琐、易污染、不易转染，且在制备细胞过程中易混入鸡胚成纤维细胞(CEF)，不利于实验操作；另外，灭活疫苗还存在灭活不彻底的隐患。所以亟需研究新的、安全性更好的抗原及其制备的疫苗。现有申请号为201610777561.1的中国专利技术专利申请中提出了一种Ι群4型禽腺病毒亚单位疫苗，该亚单位疫苗中抗原是纤维蛋白C末端的248个氨基酸序列，该抗原使用大肠杆菌表达时是包涵体表达，包涵体在纯化时需要经过复性的步骤，在工业化生产时不容易放大，成本相对较高。这有可能是因为截短体太长，含有大量的纤突蛋白的杆状(shaf)部分，截短位置不合适导致表达出来的蛋白可溶性低且产量不高。
技术实现思路
为解决现有技术的上述技术问题，本专利技术提供Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白。本专利技术还提供一种Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白的制备方法。本专利技术还提供了一种Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白用于预防I群禽腺病毒引起的包涵体肝炎等的疫苗。为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案为：一种Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白，所述蛋白为Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白球形区截短体蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。也就是说，所述蛋白为Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白球形区截短体蛋白，为Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白从氨基酸283位到氨基酸479位的抗原决定簇氨基酸序列。用于编码如上所述Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白的基因，优选地，所述基因的序列如SEQIDNO.2所示。一种Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白的制备方法，包括如下步骤：1)将编码Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白球形区截短体蛋白如SEQIDNO.1所示氨基酸的核苷酸序列克隆到原核表达载体上，得到重组表达载体；2)将1)中重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞中，得到重组工程菌；3)将2)中重组工程菌进行诱导表达，并从菌体裂解上清中纯化Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白球形区截短体蛋白。如上所述的制备方法，优选地，所述核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。如上所述的制备方法，优选地，所述步骤(1)的操作步骤为：采用如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示核苷酸序列对SEQIDNO.2所示核苷酸进行PCR扩增，将扩增产物用NcoI和XhoI双酶切后，用连接酶与pET28a原核表达载体连接，得到重组表达载体。一种Ι群4型禽腺病毒亚单位疫苗，其含有如上所述Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白和药学上可以接受的佐剂。如上所述的疫苗，优选地，所述佐剂为ISA201VG佐剂或Marcol52白油佐剂。本专利技术还提供了如上所述疫苗的应用，优选地，所述Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白的用量为0.5～50μg/羽份。最优选地，所述Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白的用量为2.5～40μg/羽份。本专利技术还提供了如上所述疫苗的应用，优选地，所述疫苗用于在预防Ι群4型禽腺病毒感染中的应用。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的一种Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白，具体为截短体蛋白为Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白从氨基酸283位到氨基酸479位的抗原决定簇氨基酸序列，共197个氨基酸。其具有良好的免疫原性，能够保护鸡免受强毒的攻击，且最低免疫剂量能达到2.5μg/只。本专利技术提供的制备抗原蛋白的方法简单，容易操作，其表达的目的蛋白即Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白有利于纯化的可溶性表达，只需要一步镍柱层析，纯度就能达到90％以上，远远满足疫苗制备的需求，而且成本低，易放大，如使用大肠杆菌表达，且目的蛋白表达量在没有优化发酵条件前能达到600mg/L。利用本专利技术制备的Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白和佐剂制备疫苗，安全性高、不存在灭活不彻底的问题(使用蛋白制备疫苗，不需要灭活)，而且免疫剂量小，制备的疫苗可用于在预防Ι群4型禽腺病毒感染措施中的应用。附图说明图1为Ι群4型禽腺病毒病毒粒子模式图。图2为密码子优化前后的Fiber-2(knob)蛋白核苷酸序列比对结果：Fiber-2(knob)表示优化前的核苷酸序列，OPTI-Fiber-2(knob)表示优化后的核苷酸序列。图3为pET28a(+)-fiber-2(knob)质粒双酶切鉴定结果，其中1、2为pET28a(+)-fiber-2(knob)质粒EcoRI/EcoRV双酶切，条带大小约4191bp，1660bp，质粒酶切正确本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白，所述蛋白为Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白球形区截短体蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白，所述蛋白为Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白球形区截短体蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.用于编码如上所述Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白的基因，其特征在于，所述基因的序列如SEQIDNO.2所示。3.一种Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将编码Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白球形区截短体蛋白如SEQIDNO.1所示氨基酸的核苷酸序列克隆到原核表达载体上，得到重组表达载体；2)将1)中重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞中，得到重组工程菌；3)将2)中重组工程菌进行诱导表达，并从菌体裂解上清中纯化Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白球形区截短体蛋白。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：林健，钱泓，吴有强，张强，杨志远，刘立新，徐玉兰，邹高溪，赵际成，段会娟，闻雪，查银河，王小蕾，程慧敏，潘洁，刘月焕，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，浙江海隆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11