基于膜结合复合物的生物体鉴别方法技术

基于膜结合复合物的生物体鉴别方法，所述膜结合复合物至少由两部分组成，分别为穿膜蛋白和信号分子，所述穿膜蛋白和信号分子通过化学键或者柔性氨基酸片段连接。本发明专利技术提供了一种快速、简便、有效的生物体鉴别的方法，只需要将生物体和蛋白混合孵育10分钟即可，不同的生物体荧光强度从几千到几百万不等，不同种生物体之间分辨率大，方法重复性和准确率非常高。

Biological identification based on membrane-bound complexes

【技术实现步骤摘要】
基于膜结合复合物的生物体鉴别方法
本专利技术属于细胞鉴别
，具体涉及一种基于膜结合复合物的生物体鉴别方法。
技术介绍
临床细菌鉴别是临床感染治疗中的常用技术，目前临床上以生化鉴别为主，一个正常的鉴定程序需要进行细菌分离、初步鉴定、生化鉴定和血清学鉴定四个步骤，每个步骤都相对繁琐，费时费力，以bioMerieux的VITEK鉴别系统为例，生化鉴定就包括63个生化反应。近年来，分子生物学技术、质谱技术、光谱技术、微流控技术、芯片技术在细菌鉴别的领域多有报道，但是这些技术都受到仪器昂贵、维护成本高、技术要求高、无法批量操作等因素的限制，至今无法得以大规模应用。目前生化鉴别方法的最好替代应该是一种价格低廉，操作简单，可大批量进行的鉴定方案。穿膜蛋白如抗菌肽就可以通过插入到细菌膜中抑制细菌的生长，且抗菌肽对各种细菌均具有恒定的最低抑菌浓度MIC。研究发现抗菌肽在特定浓度下与脂分子膜的结合比例是相对固定的。标准细胞株在科研院校和各大药企大规模用于疾病和药物的研究。近年来，细胞株的退化变异甚至污染问题日渐突出。一般的实验室鉴定方法包括镜检和基因测序，耗时较多。一些抗肿瘤肽可以以恒定比例通过插入细胞膜抑制细胞的生长。靶向治疗起步于上个世纪，随着脂质体技术的发展，靶向脂质体一度非常热门，但是直到今天也没有一个成熟的靶向脂质体进入市场。用于靶向治疗的分子大多为蛋白物质，如肿瘤特异性配体，抗体等。目前的在脂质体上修饰蛋白的方式以化学方法为主，通过EDC/NHS将蛋白修饰到功能化的脂分子上，但是这种化学方法易造成化学残余，反应难以控制，步骤复杂，工艺难以放大，故在制药领域很少应用。本专利技术将提供一种相对简单，过程温和，费时较少的非化学反应的新方法用于蛋白修饰脂质体的制备。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术提供一种基于膜结合复合物的生物体鉴别方法，将穿膜蛋白和信号分子有效结合起来，通过化学合成或者生物工程表达的方式进行生产，并应用于临床、科研和制药领域。技术方案：膜结合复合物在生物体鉴别中的应用，所述膜结合复合物至少由两部分组成，分别为穿膜蛋白和信号分子，所述穿膜蛋白和信号分子通过化学键或者柔性氨基酸片段连接。上述生物体为细菌或细胞。上述穿膜蛋白包括自然界和人工设计的抗菌肽或抗肿瘤肽。优选的，上述穿膜蛋白包括Ib-AMP1、Ib-AMP2、Ib-AMP3、Ib-AMP4、Thanatin、S-thanatin及其4个氨基酸以内的突变体。上述信号分子为化学合成的荧光分子、荧光蛋白、肿瘤特异性蛋白配体或肿瘤特异性适配体。优选的，上述荧光分子为FITC或FAM。优选的，上述荧光蛋白为GFP、YFP、RFP或BFP。优选的，上述肿瘤特异性蛋白配体为RGD肽或特异性肿瘤抗原抗体。优选的，上述肿瘤特异性适配体为DNA、RNA或多糖。优选的，上述信号分子为辣根过氧化氢和NAD(P)/NAD(P)H氧化-还原酶。有益效果：1.本专利技术提供了一种快速、简便、有效的细菌鉴别的方法，只需要将细菌和蛋白混合孵育10分钟即可，不同的细菌荧光强度从几千到几百万不等，不同种细菌之间分辨率大，方法重复性和准确率非常高。2.提供了一种快速、简便、有效的细胞鉴别的方法。无需进行基因测序，只需要和细胞孵育10分钟左右，检测荧光即可。3.提供了一种相对简单，过程温和，费时较少的非化学反应的新方法用于蛋白修饰脂质体的制备。脂质体只需要加入蛋白孵育20分钟就可以将蛋白修饰到脂质体上，本方法不需要任何化学反应，耗时短，和细胞膜结合位点单一，蛋白修饰质量可控。化学方法耗时长，需要加入化学试剂，容易造成化学残余，不易去除，而且化学方法不具有空间选择性，蛋白的结合位点随机，质量不可控，容易造成蛋白失活和脂质体交联。附图说明图1为融合蛋白的表达和纯化图。融合蛋白Ib-AMP4-GFP(lane1，2，3)和GFP-Ib-AMP4(lane5，6，7)在大肠杆菌中成功表达；融合蛋白占到总蛋白的20％(lanes3和5)且主要以溶解性蛋白的形式存在上清液中(lanes2和6)；镍柱纯化后纯度超过90％(lanes1and7)。图2为线性判别分析图。10种细菌经三种蛋白处理后，所得荧光值经线性判别分析，二维标准得分图显示双检测明显优于单检测。图3为线性判别分析图。10种细菌经一种膜结合蛋白和不同浓度的钙离子处理后，所得荧光值经线性判别分析。图4为脂质体电镜图。未经Ib-AMP4-RGD修饰的脂质体(左图)显示有光滑的边缘，经修饰后的脂质体(右图)边缘粗糙，有不规则凸起，表明蛋白结合到了脂分子膜表面。具体实施方式实施例1穿膜结合蛋白的设计、表达Ib-AMP4为一种植物抗菌肽，最早发现于Impatiensbalsamina植株中，是一种广谱抗菌肽。GFP是绿色荧光蛋白，常用于分子示踪，在溶液中可以通过荧光强度判断GFP的量的多少。Ib-AMP4-GFP，GFP-Ib-AMP4，thanatin-GFP和Ib-AMP4-GFP-RGD四种融合蛋白的制备方法一致，都是通过设计相应的核酸序列，应用基因工程的方法，构建表达质粒并在大肠杆菌中进行表达纯化，下面以Ib-AMP4-GFP和GFP-Ib-AMP4为例，介绍融合蛋白的具体制备工艺。通过基因合成的方法，合成表达Ib-AMP4和GFP蛋白的DNA，两个蛋白分子间以(GGGSG)4柔性肽相连接，为了验证Ib-AMP4在融合蛋白中的N-或者C-端膜结合能力的差异，研究设计了两个融合蛋白，Ib-AMP4分别位于GFP的N-和C-端。将合成的相应基因转入pET28a质粒中并转入大肠杆菌中进行表达，菌体回收后经细胞破碎和镍亲和柱纯化获得融合蛋白。SDS-PAGE蛋白电泳显示，两个融合蛋白都在大肠杆菌中成功表达，经纯化后，融合蛋白的纯度在90％以上(图1)。实施例2Ib-AMP4-FITC的固相合成通过以FMOC(9-芴甲氧羰基)为保护基团的固相合成法合成抗菌肽。用95％三氟乙酸、2.5％水和2.5％三异丙甲硅烷(TIA)将其从树脂上裂解。在乙醚反复沉淀后，通过反相高效液相色谱纯化多肽。纯化中采用C18反相柱：以含0.05％三氟乙酸的0％～60％乙腈为流动相，3mL/min的流速进行梯度洗脱。再将多肽以1mg/mL的浓度溶解在氧化缓冲液(100mmol/L醋酸铵，pH8.5)中，并在室温下不断搅拌3天，使其充分氧化折叠形成二硫键。最终用反相HPLC纯化至95％以上，冻干备用。C端氨基化后连接上商品化的FITC-NHS。HPLC/Mass结果显示，合成的小肽及其衍生物分子量和理论分子量一致。实施例3Ib-AMP4-GFP，thanatin-GFP和Ib-AMP4-FITC在临床细菌鉴定中的应用挑取10株临床菌株单克隆接种于新鲜培养基中，过夜培养，离心回收细菌并用5％的葡糖糖溶液洗涤3次后，将菌液稀释成OD600＝0.5的细菌悬液。取1mL细菌悬液加入1mL的不同浓度的Ib-AMP4-GFP，thanatin-GFP或者Ib-AMP4-FITC，于37摄氏度摇床中孵育20分钟后，用PBS将细菌洗涤3次，于荧光显微镜观察荧光，并用荧光分光光度计测量细菌的绿色荧光强度。所得数据用线性判别分析对细菌进行分类。结果显示经穿膜蛋白处理后，细菌被标记上绿色荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.膜结合复合物在生物体鉴别中的应用，所述膜结合复合物至少由两部分组成，分别为穿膜蛋白和信号分子，所述穿膜蛋白和信号分子通过化学键或者柔性氨基酸片段连接。

【技术特征摘要】
1.膜结合复合物在生物体鉴别中的应用，所述膜结合复合物至少由两部分组成，分别为穿膜蛋白和信号分子，所述穿膜蛋白和信号分子通过化学键或者柔性氨基酸片段连接。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述生物体为细菌或细胞。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述穿膜蛋白包括自然界和人工设计的抗菌肽或抗肿瘤肽。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述穿膜蛋白包括Ib-AMP1、Ib-AMP2、Ib-AMP3、Ib-AMP4、Thanatin、S-thanatin及其4个氨基酸以内的突变体。5.根据权利要求1所述的应用，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：范小波，吴国球，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32