在闪光和辉光反应中检测分析物制造技术

提供了样品中存在或不存在靶细胞的精确测量。例如，样品可以与能够结合到靶细胞的多个转导颗粒混合，该转导颗粒被工程化以包括核酸分子，该核酸分子被配制成一旦颗粒结合到核酸分子并且将核酸分子递送到一个或多个靶细胞中，就使靶细胞产生多个可检测的报道分子。接收与一定量的报道分子相关联的一组信号数据点，并且分析该信号数据点以准确地检测样品中的靶细胞。根据针对峰值收集和分析的数据生成曲线，使用面积比、相对光单元（RLU）的相对变化和线性阈值将该峰值在数学上变换成阳性信号数据点。公开了系统和方法。

Detection of analytes in flash and glow reactions

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在闪光和辉光反应中检测分析物
本文中描述的实施例涉及使用工程转导颗粒来检测细胞的系统和方法。
技术介绍
对细菌、特别是耐药菌株进行检测是诊断和限制细菌感染传播的关键步骤。例如，耐甲氧西林或甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（分别为MRSA和MSSA）是普通金黄色葡萄球菌细菌的耐药版本，它们在美国由很大一部分人群携带。大多数MRSA感染发生在医院，并且可能具有高死亡率（MRSA感染每年在美国造成几乎19000人死亡）。此外，碳青霉烯类耐药的肠杆菌科（CRE）或产生碳青霉烯酶的肠杆菌科（CPE）是对碳青霉烯类抗生素（被认为是此类感染的最后手段的药物）有抗药性的革兰氏阴性细菌。与MRSA一样，医院是基于CRE和CPE的感染的主要传播场所。因此，需要有效、准确和快速地识别引起感染的细菌菌株（包括其表型和/或基因型和其他分子靶标），诸如MRSA、MSSA、CRE和CPE。特别重要的是从各种各样不同的样品（例如，人类样品、环境样品、植物样品、兽医样品、食品样品等）中识别细菌表型和/或基因型和其他分子靶标以便可以用及时的方式开始适当的治疗和控制方案的能力。一种用于识别细菌的已知方法包括细菌培养。培养是高度敏感的，但通常需要两到三天（或甚至更长）来产生结果，因此不适合快速诊断或有效筛选的目的。已知的培养方法通常使用需要训练有素的人员来实行测定的系统来实行，因此不适合用在各种各样不同的环境中。已知的培养方法也易于污染，这可能导致细菌的假阳性和/或错误识别。此外，已知的培养方法采用特别定制的培养方案以用于识别各种细菌种类，因此测试广泛的细菌面板（bacterialpanel）可能快速提升成本。用于检测细菌细胞的其他已知方法包括：分离和分析核酸（诸如DNA或RNA）。用于从样品中分离核酸的已知方法通常包括若干个严格的样品制备步骤，这些步骤需要昂贵且专业的装备。特别地，这样的步骤包括：1）通过添加蛋白酶去除含有细菌或细胞的样品中的蛋白质；2）分解剩余的大量样品以暴露其中包含的核酸（也被称为细胞裂解）；3）从样品中沉淀核酸；4）洗涤和/或以其他方式制备核酸以用于进一步分析；5）分析核酸以识别种类。在制备样品后，已知的分析方法可以包括聚合酶链式反应（PCR）、基因测序、基因指纹分析、荧光、免疫测定、电化学免疫测定、微阵列、任何其他合适的技术或其组合。PCR已经找到广泛的商业用途，但是通常需要涉及昂贵试剂和仪器的多个步骤。许多涉及PCR的已知方法不适合于台式（benchtop）测试（例如，它们需要相对熟练的人员）。此外，已知的PCR方法采用热循环和/或提升的温度，这可以增加分析的成本、时间和/或复杂性。最后，因为用于检测DNA序列的PCR方法裂解了样品细胞，所以这样的方法不能区分活细胞与死细胞。用于细胞识别的一些已知系统和方法包括：使用细菌噬菌体（bacteriophage）来识别和/或检测某些细菌。在一些已知方法中，利用报道分子标记的噬菌体（phage）可以被用来瞄准和感染特定细菌菌株。感染后，噬菌体可以经历裂解循环（即，破坏细胞壁从而杀死靶细菌）和/或溶原化循环（即噬菌体与细菌一起复制而不杀死细菌），然后检测扩增后代噬菌体。依赖于噬菌体检测的这样的已知方法通常包括限制性或复杂的步骤。例如，一些已知的用于识别的基于噬菌体检测的方法依赖于噬菌体复制（在此期间可以裂解细菌），并且通常需要细胞培养以促进该过程。一些已知的基于噬菌体检测的方法需要使用仔细计量和/或pH控制的试剂从样品中去除或“解绑”特异性结合的噬菌体。此外，一些已知的基于噬菌体检测的方法依赖于仔细计量添加的噬菌体的量，和/或包括打开或关闭反应室以添加/去除试剂，这可能导致污染和/或试剂的过早混合，从而导致错误的结果以及使测定在性质上复杂。其他基于噬菌体的方法采用细菌噬菌体，其被工程化以将可以包括报道基因的核苷酸递送到靶细菌中，这使得靶细菌表达报道分子。一些已知的方法包括：在测定期间复制的噬菌体，然而，这可能导致要在其中产生报道分子的细胞发生不期望的裂解。其他已知的基于噬菌体的方法采用细菌噬菌体，其中在测定条件期间抑制复制功能。然而，由于复制功能将保持被抑制的条件（例如，温度条件）的紧密的（tight）范围，这样的已知方法难以实现。这样的方法不易控制，并且因此可能导致裂解活动。另外其他方法建议使用经历溶原化循环而非裂解循环的温和噬菌体。然而，这样的已知方法也易受零星裂解活动的影响。并入天然噬菌体生命周期也可能导致报道噬菌体宿主范围的限制，这是由于可能被前噬菌体溶原化的靶细胞的重叠感染免疫。因此，尽管已经在学术环境中实行了这种类型的已知方法，但是它们并不适用于临床环境中。除了关于使用基于噬菌体的方法的上述缺点之外，已知的方法不采用能够实现“走开”细菌噬菌体识别系统的自动化或仪器。例如，许多已知的系统不适应封闭系统处理和/或由某些报道分子产生的信号的测量，诸如例如闪光（flash）发光反应。因此，已知的系统和方法需要技术人员和密切处理样品，这可增加假阳性或假阴性的可能性。因此，需要改进的装置和方法，以用于快速、成本有效且容易地检测和识别临床样品中的细菌种类。
技术实现思路
实施例可以提供样品中存在或不存在靶细胞的准确测量。在具体实施例中，靶细胞是病原体，并且本文中描述的方法和系统可以被用来识别样品中的靶细胞是否对抗生素或一类抗生素具有抗性。在具体实施例中，将样品与能够结合到一个或多个靶细胞的多个转导颗粒混合。将转导颗粒工程化以包括被配制成使靶细胞产生可检测的报道分子的核酸分子。在足以确保该颗粒表达、结合到核酸分子并且将核酸分子递送到靶细胞中并由此表达报道分子的条件下将样品与该颗粒混合。接收一组信号数据点，它们指示报道分子的数量，并且使用信号数据点来生成曲线。然后分析该曲线以提供可检测信号的精确测量，并且通过这样做可以测量样品中存在或不存在靶细胞。因此，在一个方面，提供了检测样品中存在的一个或多个靶细胞的方法，该方法包括以下步骤：（a）将样品与能够结合到一个或多个靶细胞的多个转导颗粒混合，其中该多个转导颗粒（i）被工程化以包括被配制成使一个或多个靶细胞产生多个报道分子的核酸分子，（ii）被配制成结合到核酸分子并且将核酸分子递送到一个或多个靶细胞中，并且（iii）是非复制型的；（b）当样品中存在一个或多个靶细胞时，在足以表达多个报道分子的条件下维持样品和多个转导颗粒；（c）接收多个信号数据点，每个信号数据点与一定数量的多个报道分子相关联，其中多个信号数据点指示样品中存在一个或多个靶细胞；（d）使用多个信号数据点生成第一曲线；（e）通过基于第一曲线计算以下参数来分析第一曲线：曲线下面积（AUC）；峰下面积（A2）；面积比；全局最大强度（globalmaxRLU）；和相对变化（Rvar）；以及（f）比较面积比和Rvar，并且应用线性阈值以识别一组阳性信号数据点，其中所述组阳性信号数据点反映样品中存在一个或多个靶细胞。在一些实施例中，该方法进一步包括通过基于第一曲线进一步计算以下参数来分析第一曲线：曲线下面积（AUC）；峰下面积（A2）；全局最大强度（globalmaxRLU）；相对变化（Rvar）；信噪比（S2N）；变异系数（CV）；尖峰检测；峰值位置；指数斜率（eSlope）；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测样品中存在一个或多个靶细胞的方法，所述方法包括以下步骤：（a）将所述样品与能够结合到所述一个或多个靶细胞的多个转导颗粒混合，其中所述多个转导颗粒（i）被工程化以包括被配制成使所述一个或多个靶细胞产生多个报道分子的核酸分子，（ii）被配制成结合到所述核酸分子并且将所述核酸分子递送到所述一个或多个靶细胞中，以及（iii）是非复制型的；（b）当所述样品中存在所述一个或多个靶细胞时，在足以表达所述多个报道分子的条件下维持所述样品和所述多个转导颗粒；（c）接收多个信号数据点，每个信号数据点与一定数量的所述多个报道分子相关联，其中所述多个信号数据点指示所述样品中存在所述一个或多个靶细胞；（d）使用所述多个信号数据点生成第一曲线；（e）通过基于所述第一曲线计算以下参数来分析所述第一曲线：曲线下面积（AUC）；峰下面积（A2）；面积比；全局最大强度（globalmaxRLU）；和相对变化（Rvar）；以及（f）比较面积比和Rvar，并且应用线性阈值以识别一组阳性信号数据点，其中所述组阳性信号数据点反映所述样品中存在一个或多个靶细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.20 US 62/4367221.一种检测样品中存在一个或多个靶细胞的方法，所述方法包括以下步骤：（a）将所述样品与能够结合到所述一个或多个靶细胞的多个转导颗粒混合，其中所述多个转导颗粒（i）被工程化以包括被配制成使所述一个或多个靶细胞产生多个报道分子的核酸分子，（ii）被配制成结合到所述核酸分子并且将所述核酸分子递送到所述一个或多个靶细胞中，以及（iii）是非复制型的；（b）当所述样品中存在所述一个或多个靶细胞时，在足以表达所述多个报道分子的条件下维持所述样品和所述多个转导颗粒；（c）接收多个信号数据点，每个信号数据点与一定数量的所述多个报道分子相关联，其中所述多个信号数据点指示所述样品中存在所述一个或多个靶细胞；（d）使用所述多个信号数据点生成第一曲线；（e）通过基于所述第一曲线计算以下参数来分析所述第一曲线：曲线下面积（AUC）；峰下面积（A2）；面积比；全局最大强度（globalmaxRLU）；和相对变化（Rvar）；以及（f）比较面积比和Rvar，并且应用线性阈值以识别一组阳性信号数据点，其中所述组阳性信号数据点反映所述样品中存在一个或多个靶细胞。2.如权利要求1所述的方法，进一步包括：通过基于所述第一曲线进一步计算以下参数中的至少一个来分析所述第一曲线：信噪比（S2N）；变异系数（CV）；尖峰检测；峰值位置；指数斜率（eSlope）；质心（CM）；和相对面积（rArea）。3.如权利要求2所述的方法，进一步包括以下步骤：使用该组阳性信号数据点生成第二曲线，并且比较所述第二曲线的rArea和S2N，以识别修正的一组阳性信号数据点，其中，所述修正的一组阳性信号数据点反映所述样品中存在一个或多个靶细胞。4.如权利要求2或3中任一项所述的方法，进一步包括以下步骤：比较DeltaA2A和CM，并且应用另外的线性阈值以识别反映所述样品中存在一个或多个靶细胞的精细的一组阳性信号数据点。5.如权利要求2至4中任一项所述的方法，其中rArea=A2/（峰值区域中的最大值）。6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中面积比=A2/AUC，并且其中。7.如权利要求1至6中任一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：C霍普纳，RT库尼克，X刘，S舒克拉，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH