本发明专利技术属于质谱检测领域，具体公开了一种反应型基质3‑肼基苯甲酸衍生化葡聚糖在MALDI质谱质量校准中的应用。3‑肼基苯甲酸与还原糖末端的半缩醛发生成腙反应，该反应衍生化效率高，且利用靶板在线衍生，操作简便。利用该衍生策略，在正负离子模式下均可检测到衍生化产物。且3‑肼基苯甲酸中所带羧酸根显著提高了还原糖在负离子模式下的离子化效率。本发明专利技术用3‑肼基苯甲酸衍生化的葡聚糖作为MALDI质谱的质量校准物，相邻信号峰之间质量相差162Da，对应一个葡萄糖残基，实现了同时在正负离子模式下的精确校准。
Application of 3-hydrazinyl benzoic acid derivatized dextran in quality calibration of MALDI-TOF-MS
【技术实现步骤摘要】
3-肼基苯甲酸衍生化葡聚糖在MALDI-TOF-MS质量校准中的应用
本专利技术涉及质谱检测
，具体涉及3-肼基苯甲酸(3-HBA)作为反应型基质衍生化葡聚糖在MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)质量校准中的应用。
技术介绍
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)被广泛应用于大分子的质量测定，如蛋白质、多糖及聚合物等。精确的质荷比校准是质谱进行物质分析的首要前提，因此选择合适的质量校准物至关重要。作为质量校准物的化合物应具备：(1)精确的谱图特征，准确的分子量；(2)校准范围内谱峰丰富且相邻质谱峰差值合适；(3)容易制备，价格便宜；(4)易于储存，保质期长；(5)纯度高等特点。目前常用于校准物的物质有蛋白质、多肽混合物等，但该类校准物分离纯化成本高，对环境敏感，保存条件有较高的要求；金属簇合物，如[CsnIn-1]+和[Csn-1In]-簇合物可用于MALDI-MS正负离子模式校准，但使用该类校准物时，随着分子量增加，峰强度明显减弱；聚合物，如聚乙二醇、聚乙烯乙二醇等，T.Gruending等用聚丙胺酸校准MALDI质谱质量数，可在m/z1000～3500范围内进行校准，但正负离子的校准需分别用到DHB和CHCA作为基质，操作较繁琐。基于此，设计和开发新型MALDI质谱校准物具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术提供3-肼基苯甲酸(3-HBA)作为反应型基质，Dextran2000(D2000)为还原性葡聚糖，通过成腙反应衍生化该聚合物。该反应衍生化效率高，在正负离子模式下均能得到很强的衍生化产物信号，可用于MALDI-TOFMS的质量校准。同时，对成腙产物进行二级碎裂，可得到丰富的碎片信息，进而用于二级质量的精确校准。有机酸基质DHB和3-HBA混合使用，可显著提高糖类化合物的衍生化效率和检测灵敏度。其中，DHB为催化型基质，而3-HBA为反应型基质，DHB和3-HBA均为碳水化合物的优良基质，因此，过量的衍生化试剂不需要分离，简化了操作步骤。本专利技术所述的3-HBA结构式如式(1)所示：3-肼基苯甲酸(3-HBA)作为反应型基质衍生化葡聚糖在MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)质量校准中的应用本专利技术的3-HBA作为反应型基质衍生化葡聚糖在MALDI-TOF-MS质量校准中的应用，具体步骤如下：(1)试剂配制配制DHB(2,5-二羟基苯甲酸)甲醇溶液，将3-HBA(3-肼基苯甲酸)溶于甲醇和二甲亚砜的混合溶剂中得到3-HBA溶液，然后将DHB甲醇溶液和3-HBA溶液混合得到DHB/3-HBA混合基质溶液，将葡聚糖(D2000)溶于水中得到葡聚糖水溶液；(2)点样分别取等体积的葡聚糖水溶液和DHB/3-HBA混合基质溶液，依次点在MALDI-TOF-MS仪器的靶板的同一点上，在靶板上直接进行吸打混匀，得到点样后的靶板；(3)靶板衍生化反应点样后的靶板在60～70℃下反应20～40min，样品点完全干燥，得到含质量校准物的靶板；(4)质谱校准将含质量校准物的靶板送入MALDI-TOF-MS质谱仪，分别在正负离子模式采集数据并进行质量校正，仪器校准后所得校正参数将自动用于校准实际样品的质谱检测结果。步骤(1)中，用于溶解基质DHB(2,5-二羟基苯甲酸)的甲醇为分析纯或色谱级溶剂；甲醇和二甲亚砜的混合溶剂中甲醇与二甲亚砜的体积比为7.5～9.5:1，进一步优选为9:1，在使用时采用体积比为9:1的甲醇/二甲亚砜混合溶剂体系，将3-HBA(3-肼基苯甲酸)现配现用，3-HBA溶液为3-HBA的饱和溶液；所述的DHB甲醇溶液和3-HBA溶液的体积比为1:0.5～1.5，进一步优选为1:1。所述的DHB/3-HBA混合基质溶液中DHB的浓度为0.3～0.5mol/L，进一步优选为0.4mol/L；用于溶解葡聚糖的水是超纯水或双蒸水；所述的葡聚糖为麦芽糊精2000，Dextran2000(D2000)为还原性葡聚糖，所述的葡聚糖水溶液中葡聚糖的浓度为0.03～0.07mg/mL，进一步优选为0.05mg/mL；步骤(2)中，所述的葡聚糖水溶液的点样体积为0.5～1.0μL；所述的DHB/3-HBA混合基质溶液的点样体积为0.5～1.0μL；在靶板上直接进行吸打混匀使用移液枪直接在靶板进行重复吸打10～20次；步骤(3)中，点样后的靶板在65℃下反应30min。步骤(4)中，MALDI-TOF-MS质谱仪采用的检测方式为正离子或负离子模式下的反射模式；另一方面，本专利技术还提供了利用衍生化的D2000进行仪器校准后，对实际样品进行测定和分析的方法。本专利技术中所述的“MALDI质谱”是指基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)，简称为MALDI质谱。MALDI的工作原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给样品分子而使其电离的过程。它是一种软电离技术，适用于生物大分子的测定。本专利技术中所述的“反应型基质”是指作为常规基质辅助还原糖电离的同时，可与其还原端半缩醛发生快速反应，共价结合离子化标签，提高电离化效率。本专利技术中所述的“酸性糖”是指带有羧基(-COOH)酸性取代基的还原糖，如含有唾液酸的糖分子。本专利技术中所述的“中性糖”是指不含有酸性取代基的还原糖分子。本专利技术中所述的衍生化效率＝衍生化产物峰强度/(衍生化产物峰强度+未衍生的峰强度)。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)3-HBA结构中带有活性基团肼基，与多糖发生成腙反应，该反应在弱酸条件下进行，衍生化效率高。反应型基质3-HBA除了作为衍生化试剂外，还可以作为基质辅助样品离子化，因此反应过量的衍生化试剂不需要分离；(2)3-HBA与DHB形成组合型基质，共同作用提高样品离子化效率。DHB为有机酸基质，可显著催化成腙反应的进行。本专利技术提供的靶板衍生化方法，操作简便，大大提高了效率；(3)3-HBA结构中带有羧基，容易失去质子在负离子模式下出峰，通过本专利技术提供的方法能够显著提高中性糖及酸性糖在负离子模式下的检测灵敏度，克服了多糖在负离子模式检测灵敏度低等问题；(4)本专利技术中，正负离子模式下均能检测到很强的衍生化产物峰，实现了正负离子模式下同时对MALDI-TOFMS的精确质量校准，且在二级质谱中能得到质量数差值同样为162Da的特征性碎片峰，因而还可以进行二级质谱校准。通过选用不同聚合度的葡聚糖可实现不同质荷比范围内的精确校准；(5)本专利技术中所用的样品制备简单，来源广泛，成本低廉，易于储存。校准方法操作简单，选用葡聚糖作为校准物质量分布均匀，准确度高。附图说明图1为本专利技术3-HBA衍生化还原糖的原理示意图；图2为不同反应条件下麦芽六糖(G6)的衍生化效率；图2a不同反应时间；图2b不同反应温度；图2c溶剂中不同乙酸含量；图2d不同DHB浓度；图3为负离子模式下不同浓度D2000的MALDI质谱图；图3aD2000浓度为0.05mg/mL；图3bD2000浓度为0.5mg/mL；图3cD2000浓度为5mg/mL；图4为标准条件下衍生化D2000的MALDI质谱图；图4a正负离子模式下的一级质谱图；图4b负离子模式下母离子为m/z2257.89本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.3‑肼基苯甲酸作为反应型基质衍生化葡聚糖在MALDI‑TOF‑MS质量校准中的应用。
【技术特征摘要】
1.3-肼基苯甲酸作为反应型基质衍生化葡聚糖在MALDI-TOF-MS质量校准中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的3-肼基苯甲酸如式(1)所示：3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体步骤如下：(1)试剂配制DHB为2,5-二羟基苯甲酸，配制DHB甲醇溶液，3-HBA为3-肼基苯甲酸，将3-HBA溶于甲醇和二甲亚砜的混合溶剂中得到3-HBA溶液，然后将DHB甲醇溶液和3-HBA溶液混合得到DHB/3-HBA混合基质溶液，将葡聚糖溶于水中得到葡聚糖水溶液；(2)点样分别取等体积的葡聚糖水溶液和DHB/3-HBA混合基质溶液，依次点在MALDI-TOF-MS仪器的靶板的同一点样孔上，在靶板上直接进行吸打混匀，得到点样后的靶板；(3)靶板衍生化反应点样后的靶板在60～70℃下反应20～40min，样品点完全干燥，得到含质量校准物的靶板；(4)质谱校准将含质量校准物的靶板送入MALDI-TOF-MS质谱仪，分别在正负离子模式采集数据并进行质量校正，仪器校准后所得校正参数将自动用于校准实际样品的质谱检测结...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘远江，赵晓勇，黄钰，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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