一种高效清除细胞培养过程中支原体污染的配方组成比例

本发明专利技术的高效清除细胞培养过程中支原体污染的配方，由抗菌肽BMAP‑18和BMAP‑18‑R9组成，其中BMAP‑18具有杀灭细胞外支原体的功能；BMAP‑18‑R9在R9穿膜肽的作用下进入到细胞中，杀灭细胞内的支原体。两者相结合就可以彻底杀灭细胞内外的支原体。同时，这两者单独使用和联合使用，200uM浓度内，对细胞没有毒性作用。

An efficient formula for removing mycoplasma contamination in cell culture

【技术实现步骤摘要】
一种高效清除细胞培养过程中支原体污染的配方
本专利技术属于生命科学领域，具体涉及一种清除细胞培养过程中支原体污染的配方。
技术介绍
支原体是一种大小仅为0.2-0.3um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45um）的原核生物，在细胞培养过程中，支原体感染发生率达到63%，因而细胞培养过程中被支原体污染是一个世界性的难题。当细胞（特别是传代细胞）被支原体污染后，细胞内的DNA、RNA及蛋白表达发生改变，而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，因而细胞被支原体污染一般难以察觉，最终，导致实验结果重现性差等严重问题。目前，已有文献报道BMAP-18是一种抗菌肽可以清除常见的致病菌（https://doi.org/10.1016/j.peptides.2011.03.024），但是没有报道其可以清除支原体。R9是由9个R组成的氨基酸序列，是一个人工设计的穿膜肽（CPPs）。我们通过实验发现BMAP-18对细胞培养污染的支原体有一定的清除效果，但是无法做到100%的清除，可能的原因是BMAP-18无法清除细胞内部的支原体。因此，我们引入穿膜肽R9，将BMAP-18带入到细胞内，达到彻底杀灭胞内支原体的目的。鉴于此，我们设计并验证了一种新的抗菌肽组合，可以作为清除细胞培养过程中支原体污染的有效。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是开发一种可以同时杀灭细胞内和细胞外支原体的抗菌肽配方。本专利技术的抗菌肽配方，所述抗菌肽是由BMAP-18和BMAP-18-R9组合而成。其中的BMAP-18可以清除常见的致病菌和支原体。BMAP-18-R9不仅可以清除常见的细胞外致病菌和支原体，也可以同时清除细胞内常见的致病菌和支原体。所述抗菌肽BMAP-18的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。所述SEQIDNO.2的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，其中：图1为本专利技术的BMAP-18清除胞外支原体的验证实验结果图；图2为本专利技术的BMAP-18-R9清除胞内支原体的验证实验结果图；图3为本专利技术的BMAP-18和BMAP-18-R9混合使用清除胞内支原体的验证实验结果图；图4为本专利技术的BMAP-18和BMAP-18-R9细胞毒性实验结果图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明。试验例中所涉及的BMAP-18和BMAP-18-R9，委托第三方公司采用化学合成方式获得，稀释成1M的储存母液，-20℃保存备用。所用的阳性对照支原体种类为猪鼻支原体(M.Hyorhinis)。采用检测方法为商业化的PCR检测试剂盒。试验例1本实施例的BMAP-18杀灭细胞外支原体的验证步骤为：1、将支原体污染的细胞上清弃去，PBS清洗三遍后，加入混入BMAP-18的完全培养基，使得终浓度为100uM；2、连续培养三天，每天重复上一步操作1次；3、连续培养四天，胰酶消化细胞并用PBS重悬，2000g离心20min；4、分别取上清和细胞，PCR检测其中支原体污染的情况。结果发现，和对照组相比（图1），上清中没有支原体污染，而细胞裂解液中有支原体污染，说明BMAP-18只能清除细胞外的支原体，而不能清除细胞内的支原体。试验例2本实施例的BMAP-18-R9杀灭细胞内支原体的验证步骤为：1、将支原体污染的细胞上清弃去，PBS清洗三遍后，加入混入BMAP-18-R9的完全培养基，使得终浓度为100uM；2、连续培养三天，每天重复上一步操作1次；3、连续培养四天，胰酶消化细胞并用PBS重悬，2000g离心20min；4、分别取上清和细胞，PCR检测其中支原体污染的情况。5、结果发现(图2)，和对照组相比，上清中有支原体污染，但是污染比对照组要弱很多；同时，细胞裂解液中无支原体污染，说明大部分的BMAP-18-R9进入到细胞内，清除了细胞内的支原体污染。试验例3本实施例的BMAP-18和BMAP-18-R9杀灭细胞内外支原体的验证步骤为：1、将支原体污染的细胞上清弃去，PBS清洗三遍后，加入混入BMAP-18和BMAP-18-R9的完全培养基，使得终浓度各为100uM；2、连续培养三天，每天重复上一步操作1次；3、连续培养四天，胰酶消化细胞并用PBS重悬，2000g离心20min；4、分别取上清和细胞，PCR检测其中支原体污染的情况。5、结果发现，和对照组相比（图3），上清和细胞裂解液中基本没有支原体污染，说明BMAP-18和BMAP-18-R9混合使用可以更好的清除细胞内外的支原体。试验例4本实施例的BMAP-18-R9的体外抑菌实验：按照管碟法实验步骤，验证BMAP-18-R9的抑菌实验。其检测结果如下表所示：受试菌种MIC(uM)大肠杆菌10沙门氏菌40绿脓杆菌50金黄色葡萄球菌50上述抑菌实验结果表明：本专利技术的所述的抗菌肽BMAP-18-R9对大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌具有体外抑菌活性。试验例4本实施例的BMAP-18和BMAP-18-R9的细胞毒性实验将293T细胞在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，培养至对数期，然后用PBS清洗三遍后，加入0.25%的胰蛋白酶消化至单细胞；接着，加入完全培养基终止消化，弃掉，再加入DMEM培养基后，在1000RPM的转速下离心5分钟，弃上清；然后，加入完全培养基悬浮细胞，调整至细胞密度为1×106个/mL后铺96孔板，每孔200uL，待细胞贴壁后加入不同浓度的BMAP-18、BMAP-18-R9和BMAP-18/BMAP-18-R9，置于二氧化碳培养箱中，在37℃、5%CO2的条件下培养24小时；培养结束后，每孔中加入20uL的CCK-8溶液，继续培养2小时，最后，采用酶标仪检测450nm波长的吸光值。检测结果如图4所示，抗菌肽的细胞毒性实验结果为三次独立实验结果的平均值。从图4中得出，抗菌肽的浓度到达200uM以上，对细胞有明显毒性。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利技术创造的保护范围之中。序列表<110>南京千济诺生物科技有限公司<120>一种高效清除细胞培养过程中支原体污染的配方<130><160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>18<212>PRT<213>人工序列<400>1GlyArgPheLysArgPheArgLysLysPheLysLysLeuPheLysLys151015LeuSer<210>2<211>27<212>PRT<213>人工序列<400>2GlyArgPheLysArgPheArgLysLysPheLysLysLeuPheLysLys151015LeuSerArgArgArgArgArgArgArgA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效清除细胞培养过程中支原体污染的配方，其特征在于，所述配方的主要成分为抗菌肽BMAP‑18和BMAP‑18‑R9。

【技术特征摘要】
1.一种高效清除细胞培养过程中支原体污染的配方，其特征在于，所述配方的主要成分为抗菌肽BMAP-18和BMAP-18-R9。2.根据权利要求1所述抗菌肽BMAP-18，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述抗菌肽BMAP-18-R9，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。4.根据权利要求1所述一种高效清除细胞培养过程中支原体污染的配方，其特征在于，BMAP-18和BMAP-18-R9的比例置于1:100和100:1之间。5.根据权利要求1中所述的所述抗菌肽BMAP-18和BMAP-18-R9，其特征在于，其生产方...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘继来，
申请(专利权)人：南京千济诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32