In order to express Bacillus subtilis lysate of antimicrobial peptide BMAP 18, the animal feed additive of the invention integrates multiple copies of the gene expressing BMAP 18 into the genome of Bacillus subtilis by CRISPR/Cas9 technology, constructs an engineering bacteria with high yield and stable expression, and then carries out large-scale culture of the engineering bacteria. After fermentation, the bacteria expressing BMAP 18 were directly lysate and dried at high temperature and added to animal feed. The animal feed additive of the invention has the advantages of low production cost, high yield and good stability of Engineering bacteria, and can effectively increase animal resistance when added to animal feed.
【技术实现步骤摘要】
一种动物饲料添加剂及其制备方法与应用
本专利技术属于生命科学领域，具体涉及一种动物饲料添加剂及其方法与应用。
技术介绍
长期以来，抗生素作为饲料添加剂应用于养殖业取得了很好的效果。然而，大量的基础研究表明，抗生素在养殖业中长期大量的使用造成严重的耐药现象和畜产品药物残留，极大的威胁人类的健康安全。因此，欧盟等发达国家已经全面禁止畜禽饲料中使用抗生素，寻找抗生素替代品便成为当前研究的重要方向之一。在养殖业涉及的各类动物中，由于仔猪免疫系统发育并不完善，很容易感染有害细菌而影响其生产性能，严重者甚至死亡，因此仔猪的饲料中营养要求较高。抗菌肽作为自然界生物中广泛存在的一种小分子活性多肽，普遍具有广谱抗菌活性，因其采用物理抗菌的机制，所以不易产生耐药性，是替代抗生素的潜在物质。但是抗菌肽的合成和纯化面临高昂的成本，而采用传统的大肠杆菌表达体系表达，虽然成本很低，但是面临内毒素难以去除的难题，限制了抗菌肽在饲料添加剂的应用。中国专利文献CN105255935A中公开的抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌中的表达方法，解决了大肠杆菌表达体系表达的缺陷，其通过分子生物学技术，选择表达载...
【技术保护点】
1.一种动物饲料添加剂，其特征在于，所述动物饲料添加剂为表达抗菌肽BMAP‑18的枯草芽孢杆菌裂解物，所述抗菌肽BMAP‑18的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种动物饲料添加剂，其特征在于，所述动物饲料添加剂为表达抗菌肽BMAP-18的枯草芽孢杆菌裂解物，所述抗菌肽BMAP-18的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的动物饲料添加剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为非致病性的枯草芽孢杆菌。3.一种制备权利要求1或2中所述的动物饲料添加剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将具有如SEQIDNO.2所示的碱基序列的第一引物与具有如SEQIDNO.3所示的碱基序列的第二引物进行杂交，得到具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序的抗菌肽BMAP-18；所述抗菌肽BMAP-18具有BamHI和XbaI酶切位点；(2)以BamHI和XbaI为酶切位点，将步骤(1)中得到的所述抗菌肽BMAP-18连接到pHT01载体中，构建成表达载体pHT01/BMAP-18；(3)将步骤(2)中得到的所述表达载体pHT01/BMAP-18在TOP10中扩增，并提取pHT01/BMAP-18质粒；(4)将步骤(3)中得到的所述pHT01/BMAP-18质粒和pCas9载体共转化到枯草芽孢杆菌中，在LB固体培养基上培养3-7天；(5)从步骤(4)中培养后的所述LB固体培养基上挑取阳性单菌落，将其接种到液体培养基中，培养1-7天后，再将培养得到的工程菌发酵1-7天；(6)将步骤(5)中发酵后得到的工程菌进行离心，收集菌体，将收集到的菌体破碎，采用无菌水溶解菌体，将混合得到的混合液离心，留上清液，并将其干燥，即得。4.根据权利要求3中所述的制备动物饲料添加剂的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括如下步骤：(a)将pHT01载体转化为DH5α感受态细胞，并将其涂布于含有Ampicillin的LB-Amp固体培养基上，培养8-24h，再挑取单菌落接种于LB-Amp液体培养基上，在温度为37±2℃、转速为150-250rpm的条件下，培养6-12h，提取pHT01质粒；(b)将步骤(a)中得到的所述pHT01质粒、BamHI和XbaI置于37±2℃的温度下进行双酶切反应，反应3-4h后将反应液离心，然后进行电泳鉴定；鉴定无误后，将酶切产物回收；(c)将步骤(b)中的得到的酶切产物中回收的pHT01载体大片段与所述抗菌肽BMAP-18进行连接，构建得到所述pHT01/BMAP-18表达载体。5.根据权利要求4中所述的制备动物饲料添加剂的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括如下步骤：(d)将所述步骤(c)中得到所述pHT01/BMAP-18表达载体转化到DH5α感受态细胞，得到重组质粒pHT01/BMAP-18；(e)将步骤(d)中重组质粒pHT01/BMAP-18，挑取10个单个菌落分别接种于LB-Amp液体培养基上，在温度为37±5℃、转速为150-250rpm下培养6-12h，提取得到所述pHT01/BMAP-18质粒。6.根据权利要求5中所述的制备动物饲料添加剂的方法，其特征在于，所述步骤(4)具体包括如下步骤：(f...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘继来，白锟，
申请(专利权)人：南京千济诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。