一种生产A40926的发酵培养基和发酵方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种生产A40926的发酵培养基和发酵方法。所述的发酵培养基，包含碳源和氮源，所述氮源包含脯氨酸，且用量按重量百分比计为0.05％～0.6％。本发明专利技术进一步涉及一种使用所述培养基生产A40926的发酵方法。本发明专利技术通过优化A40926的发酵培养基和发酵方法，克服了现有技术中A40926的发酵产率低，菌体过早衰老，无法达到生产化的要求，以及组分中杂质高，下游纯化成本高的问题，从而提供了一种产量高、杂质小、下游纯化成本低的发酵培养基，和操作简单，能够大规模生产的发酵方法。

A Fermentation Medium and Method for Producing A40926

【技术实现步骤摘要】
一种生产A40926的发酵培养基和发酵方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种生产A40926的发酵培养基和发酵方法。
技术介绍
随着抗生素的广泛使用，细菌耐药性问题日益严重，尤其是耐革兰阳性菌。糖肽类抗生素对几乎所有的革兰氏阳性细菌都有活性，在临床常用于葡萄球菌、肠球菌和肺炎链球菌所致严重感染性疾病的治疗。万古霉素和替考拉宁是临床上普遍应用的两个重要的糖肽类抗生素，在其发现之初,缓解了耐药细菌的问题,人们称它们为“人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线”。但由于临床应用的扩大和不合理用药，导致了耐药菌的出现，例如出现耐万古霉素肠球菌(VER)、对万古霉素中度敏感的金黄色葡萄球菌(VISA)以及耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)，寻找新的糖肽类抗生素已成为临床治疗的迫切需求。1984年，科学家在培养分离自土壤的马杜拉(Actinomadura)菌时发现了抗生素A40926。并于1984年6月8日将菌株保藏于美国组织培养物保藏中心(AmericanTissueCultureCollection，ATCC)，编号ATCC39727。该菌株最初被认为属于链霉菌属，后经进一步研究，特别是对细胞壁合成的研究，在2003年，将其产生菌归类于野野村放线菌属(Nonomuraea.sp)A40926是由野野村放线菌属Nonomuraeasp.ATCC39727代谢产生的一种天然糖肽类抗生素，是半合成抗生素达巴万星(Dalbavancin)的前体物质。其作用机制与万古霉素和替考拉宁相同，可抑制革兰阳性菌细胞壁的生物合成，对甲氧西林敏感金葡球菌(MSSA)、耐甲氧西林金葡球菌(MRSA)等革兰阳性菌以及革兰阳性厌氧菌均具有抗菌活性。2014年5月，FDA批准达巴万星用于治疗成人皮肤及软组织感染，成为第一个FDA批准的一周给药一次的，给药两周的静脉注射抗生素。达巴万星半衰期长，用药副作用小，为临床治疗革兰阳性菌提供了新的选择。A40926是一种多组分混合物，含有5个主要的组分A0、A1、B0、B1和B2，其中B0占80％以上，是其主要的活性成分。A40926B组分经过化学结构修饰后可得到新型糖肽类抗生素达巴万星。A40926及其各组分化学结构式如下：目前，关于A40926的生产主要存在两个技术难点：1)发酵产率或效价低。A40926主要由意大利的VicuronPharmaceuticals制药公司通过发酵进行生产，但其报道的发酵配方仅为一些简单的无机盐培养基，培养温度为28℃，培养时间160h。由于其发酵培养基中的营养成分仅为一些简单的无机盐，菌体活力较差，发酵单位较低，其报道的最高效价为128mg/L。此外，中国专利技术专利申请CN103060405A也公开了一种A40926的发酵工艺，该专利技术通过流加补料培养使得A40926产量达到720mg/L。现有技术中基于B0组分效价的提升，A40926的产量通常都不超过1000mg/L。2)下游纯化成本高。用野野村放线菌属(Nonomuraeasp.)发酵生产糖肽类抗生素A40926，利用HPLC分析A40926发酵液中各组分和杂质情况，发现存在2个杂质峰，分别命名为杂质1和杂质2，这两个杂质在后续纯化中较难去除，且纯化成本高。因此，提高A40926的产量，降低其发酵过程中的杂质组分，减少下游纯化的成本是急需解决的技术问题。本专利技术正是基于这样的目的进行了研究并提供了一种较优的A40926的发酵培养基和发酵方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是通过优化A40926的发酵培养基和发酵方法，克服了现有技术中A40926的发酵产率低，菌体过早衰老，无法达到生产化的要求，以及组分中杂质高，下游纯化成本高的问题，提供了一种较优的发酵培养基和一种操作简单，纯化成本低，能够大规模生产A40926的发酵方法。本专利技术的上述技术目的是通过下述技术方案实现：本专利技术提供一种用于生产A40926的发酵培养基，包含碳源和氮源，所述的氮源包含脯氨酸，且用量按重量百分比计为0.05％～0.6％；在一些实施方案中，脯氨酸的用量为0.1％；在另一些实施方案中，脯氨酸的用量为0.4％；在又一些实施方案中，脯氨酸的用量为0.5％。在本专利技术的一些实施方案中，所述的氮源包含酵母粉，且用量按重量百分比计为0.2％～4.0％；在一些实施方案中，酵母粉用量为1.2％；在一些实施方案中，酵母粉用量为3.0％。在本专利技术的一些实施方案中，所述的氮源按重量百分比计，包含选自以下组分中的一种或多种：缬氨酸0.05％～0.30％、热炸黄豆饼粉0.5％～4.0％、酵母抽提物0.1％～0.3％、大豆蛋白胨0.2％～1.0％；在一些实施方案中，氮源包含缬氨酸0.15％、热炸黄豆饼粉1.5％，大豆蛋白胨0.8％；在一些实施方案中，氮源包含缬氨酸0.15％、热炸黄豆饼粉3.5％，大豆蛋白胨0.8％；在一些实施方案中，氮源包含缬氨酸0.15％、热炸黄豆饼粉0.5％，大豆蛋白胨0.8％；在一些实施方案中，氮源包含缬氨酸0.15％、热炸黄豆饼粉1.5％，酵母抽提物0.3％。在本专利技术的一些实施方案中，所述的碳源按重量百分比计，包含可溶性淀粉0.5％～6.0％和/或蔗糖0.5％～5.0％；在一些实施方案中，碳源包含可溶性淀粉3.0％和蔗糖2.5％。在本专利技术的一些实施方案中，所述的发酵培养基中还包含选自以下组分中的一种或多种的盐类：硫酸镁、碳酸钙、氯化镁、氯化钠；在一些实施方案中，发酵培养基中包含硫酸镁、碳酸钙；在一些实施方案中，发酵培养基中包含硫酸镁、碳酸钙、氯化钠。在本专利技术的一些实施方案中，公开了一种使用权利要求1-5任意一项所述的培养基生产A40926的发酵方法，具体包括如下步骤：(a)将野野村放线菌菌株在斜面培养基中培养8～10d；(b)取斜面菌丝接种至种子培养基中进行摇床培养；(c)取3％～15％的接种量转接到发酵培养基中进行发酵培养，150～300h后放罐。在本专利技术的一些实施方案中，所述的野野村放线菌为ATCC39727菌株。在本专利技术的一些实施方案中，所述的发酵培养基的pH为5.0～8.5；在一些实施方案中，发酵培养基的pH为7.8～8.0；在一些实施方案中，发酵培养基的pH为6.0～6.5；在一些实施方案中，发酵培养基的pH为5.0～5.2。在本专利技术的一些实施方案中，所述的发酵培养的温度为30～40℃；在一些实施方案中，发酵培养基的温度为34℃。在本专利技术的一些实施方案中，所述的种子培养基按重量百分比计，选自以下组分中的一种或多种：可溶性淀粉0.5％～3.0％，葡萄糖0.5％～2.0％，酵母粉0.1％-0.5％，大豆蛋白胨0.2％～1.0％，NaCl0.05％～0.3％；种子培养基pH7.8～8.0；在一些实施方案中，种子培养基按重量百分比计，包含可溶性淀粉1.5％，葡萄糖1.0％，酵母粉0.2％，大豆蛋白胨0.5％，NaCl0.15％；种子培养基pH7.8～8.0。在本专利技术的一些实施方案中，所述的斜面培养采用的培养基是在发酵培养基配方的基础上添加1.8％-2.0％琼脂。本专利技术所述的“酵母浸粉”是指粉状酵母浸出物，主要成分是经过降解的蛋白质、氨基酸、核甘酸；维生素、生长素、微量元素等营养物质含量也比较丰富，并最符合微生物生产所需的营养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于生产A40926的发酵培养基，包含碳源和氮源，其特征在于，所述氮源包含脯氨酸，且用量按重量百分比计为0.05％～0.6％。

【技术特征摘要】
1.一种用于生产A40926的发酵培养基，包含碳源和氮源，其特征在于，所述氮源包含脯氨酸，且用量按重量百分比计为0.05％～0.6％。2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述氮源包含酵母粉，且用量按重量百分比计为0.2％～4.0％。3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述氮源按重量百分比计，包含选自以下组分中的一种或多种：缬氨酸0.05％～0.30％、热炸黄豆饼粉0.5％～4.0％、酵母抽提物0.1％～0.3％、大豆蛋白胨0.2％～1.0％。4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述碳源按重量百分比计，包含可溶性淀粉0.5％～6.0％和/或蔗糖0.5％～5.0％。5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，包含选自以下组分中的一种或多种的盐类：硫酸镁、碳酸钙、氯化镁、氯化钠。6.一种使用权利要求1-5任意一项所述培养基生产A4...

【专利技术属性】
技术研发人员：高新兵，吴波，鲍素敏，谢文平，陈锡欣，李文佳，李峰，
申请(专利权)人：东莞东阳光药物研发有限公司，宜昌东阳光药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44