一种大规模分离、纯化制备唾液酸糖肽（SGP）的方法技术

本发明专利技术公开了一种大规模分离、纯化制备唾液酸糖肽(SGP)的方法，包括：(1)取新鲜未受精的鸡蛋黄，经过苯酚处理，离心取上清浓缩后，冻干得唾液酸糖肽粗品；(2)取医用脱脂棉装填成棉花亲水色谱柱；(3)将唾液酸糖肽粗品的溶液加到棉花亲水色谱柱上；(4)将棉花亲水色谱柱用乙腈梯度洗脱除盐和杂质，用水将糖肽洗脱冻干得到唾液酸糖肽的纯品。本发明专利技术方法省略了以往方法中Sephadex G‑50分离，Sephadex G‑25除盐、离子交换色谱纯化等繁琐步骤，反应条件温和，降低了实验成本、缩短了纯化周期、提高了效率，纯度检测制备的唾液酸糖肽纯度达95％以上。本发明专利技术不仅适用于实验室糖肽的富集，还可用于工业生产。

A method for large-scale separation and purification of sialic acid glycopeptide (SGP)

The invention discloses a method for large-scale separation and purification of sialic acid glycopeptide (SGP), which includes: (1) extracting fresh unfertilized egg yolk, treating with phenol, centrifuging supernatant and concentrating, freezing-drying to obtain crude sialic acid glycopeptide; (2) taking medical degreased cotton and filling it into cotton hydrophilic chromatographic column; (3) adding the solution of crude sialic acid glycopeptide to cotton hydrophilic chromatographic column; (4) adding cotton Salt and impurities were removed by gradient elution of acetonitrile on hydrophilic column, and glycopeptides were eluted and lyophilized with water to obtain pure sialic acid glycopeptides. The method omits the tedious steps of Sephadex G_50 separation, Sephadex G_25 desalting and ion exchange chromatography purification in the previous methods, and the reaction conditions are mild, the experimental cost is reduced, the purification period is shortened, and the efficiency is improved. The purity of sialic acid glycopeptide prepared by purity detection is over 95%. The present invention is not only suitable for the enrichment of glycopeptides in laboratory, but also suitable for industrial production.

【技术实现步骤摘要】
一种大规模分离、纯化制备唾液酸糖肽(SGP)的方法
本专利技术涉及一种糖肽化合物的分离纯化方法，着重阐述了唾液酸糖肽的分离纯化，属于生物化学

技术介绍
唾液酸糖肽(Sialylglycopeptides,SGP)是一种从新鲜鸡蛋黄中提取到的具有天然复杂型N糖链的糖肽，由十一个单糖与六个氨基酸组成，其非还原末端通常为两个唾液酸，又称为双唾液酸糖肽(其结构如下所示)。SGP有许多重要的生物活性，如可以作为拮抗剂抑制细菌及病毒与宿主细胞的结合，在抗菌方面可以抑制沙门菌等细菌与人类肠道细胞与小鼠组织细胞的结合。SGP中唾液酸化的α-(2→6)N-乙酰氨基乳糖残基还可以作为配体与A型人流感病毒血凝素结合，由此抑制流感病毒与宿主细胞的结合。因此，SGP有着成为良好抗菌、抗病毒预防类药物的潜力。更为重要的是由于糖链合成的困难，SGP中的糖链可以作为糖基供体，用于合成带有N-糖链的亲脂类化合物、糖簇的合成，还可以将该糖链连接到带有GlcNAc的糖蛋白或糖肽上，合成新的糖蛋白和糖肽。随着唾液酸糖肽在糖蛋白合成和修饰等领域的广泛应用，该糖肽的制备和生产引起了糖生物学领域的关注。目前，制备SGP的方法主要有2种。第一种是1997年日本AkiraSeko[1]首次报道的从鸡蛋黄中分离纯化唾液酸糖肽的方法，也是目前主要的SGP制备方法。该方法对蛋黄进行苯酚处理后，经过两次SephadexG-50分离，经SephadexG-25除盐、再经DEAE-Toyopeael650M离子交换柱纯化，最后SephadexG-25除盐后冻干得到样品,后期该实验室在纯化方面做出了进一步改进提出用高效液相色谱(HPLC)对SGP进行纯化，但用上述方法纯化SGP时，具有步骤多，成本高，周期长，样品损失较大，上样量少等缺点。第二种方法是YangZou[2]报道的。他们先用苯酚处理新鲜的鸡蛋卵黄，去除蛋白，再用SephadexG-50进行分离，最后用活性炭柱进行纯化和脱盐，该方法虽然简化了一些步骤，但周期相对本专利技术方法仍然较长，柱填料成本较高。因此开发一种成本低廉、周期短、步骤少、效率高的SGP大规模分离纯化方法显得尤为迫切和必要。[1]SekoA,KoketsuM,NishizonoM,etal.Occurrenceofasialylglycopeptideandfreesialylglycansinhen'seggyolk[J].BiochimBiophysActa,1997,1335:23-32.[2]ZouY,WuZ,ChenL.Anefficientapproachforlarge-scaleproductionofsialyglycopeptidesfromeggyolks[J].JCarbohydrChem,2012,31:436-446.
技术实现思路
针对现有唾液酸糖肽分离技术中存在的步骤多、周期长、成本高等缺点，本专利技术的目的是提供一种周期短、成本低、效率高的分离、纯化制备唾液酸糖肽(SGP)的方法。为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：该方法包括以下步骤：(1)取新鲜未受精的鸡蛋黄，经过苯酚处理，离心取上清浓缩后，冻干得唾液酸糖肽粗品；(2)取脱脂棉装填成棉花亲水色谱柱；(3)取步骤(1)得到的唾液酸糖肽粗品配置溶液，加到步骤(2)得到的棉花亲水色谱柱上，并作干燥处理；(4)对步骤(3)得到的棉花亲水色谱柱用浓度75％以上的乙腈水溶液洗脱除盐和杂质；(5)最好用纯水将糖肽洗脱，冻干得到唾液酸糖肽的纯品。基于以上方案，本专利技术还进一步作了如下优化：步骤(2)中，将脱脂棉均匀装填后，依次采用纯水和乙腈分别清洗，然后在烘箱里烘干，温度优选50-60℃，得到棉花亲水色谱柱。步骤(3)中，冻干的唾液酸糖肽样品溶于水中，配成浓度为100-150mg/mL的溶液。步骤(4)采用100％、95％、85％、75％的乙腈水溶液进行梯度洗脱；或者采用75％-90％的乙腈水溶液持续洗脱。若以棉花亲水色谱柱容积1mL计，则装填的脱脂棉为150mg，步骤(3)中上样的唾液酸糖肽粗品配置溶液为500uL，步骤(4)中乙腈水溶液总用量为40-60mL(若采用梯度洗脱，各梯度用量优选10-15mL)，步骤(5)中纯水用量为4mL。根据需要，可相应增加用量。所述的脱脂棉优选医用脱脂棉。在步骤(3)中，唾液酸糖肽粗品的溶液加入棉花柱前，先以12000rpm离心3min除去不溶物。上样过程中避免液体从柱中流出，并及时干燥。在步骤(1)中，新鲜鸡蛋黄的处理方法是：取新鲜未受精的鸡蛋黄，加入等体积的水使之搅拌均匀。为了达到变性的目的，加入十倍体积的苯酚水溶液(水：苯酚＝9:1)，持续搅拌2h，然后加入2L的纯水，4500g离心30min，上清置于旋转蒸发仪中减压浓缩，并冻干处理，得到唾液酸糖肽粗品。本专利技术省略了现有技术中SephadexG-50分离，SephadexG-25除盐、离子交换色谱纯化等繁琐步骤，反应条件温和，降低了实验成本、缩短了纯化周期、提高了效率。具体有以下有益效果：1、本专利技术利用了脱脂棉含有大量羟基，具有强亲水性的特性，制作棉花亲水色谱柱，并通过简单的洗脱操作即可获得唾液酸糖肽纯品，收率较高且纯度达95％以上。2、由于脱脂棉的成本较低，且制作棉花亲水色谱柱以及洗脱环节非常简便，因此大大降低了整体成本。3、洗脱条件温和，不再加入三氟乙酸或甲酸，防止了唾液酸脱落。4、缩短了纯化周期，从上柱到获得最终的唾液酸糖肽产品，前述现有技术(第二种)通常需要两周时间，而本专利技术只需要两天的时间。5、不仅适用于实验室制备，也可用于工业生产(只需配置常规的反应罐，增加棉花的填入量即可)。附图说明图1：纯化前和纯化后糖肽的质谱图；其中：负离子模式检测唾液酸糖肽，953.9为样品三电荷峰，1431.3为样品双电荷峰，与唾液酸糖肽2866分子量吻合。结构式中的■表示N-乙酰葡萄糖胺、●表示高甘露糖、○表示半乳糖、◆表示唾液酸。图2：唾液酸糖肽经过PNGaseF酶切后肽段的质谱图(正离子模式)。图3：肽段的MS2质谱图。图4：HPLC检测唾液酸糖肽样品图谱；其中：柱子：C18柱；流动相：10％乙腈水溶液(含0.1％TFA)；流速：0.8mL/min；检测波长：214nm.具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本专利技术作详细的介绍。新鲜未受精鸡蛋购买于当地农贸市场；医用脱脂棉购买于校医院；糖苷酶(PNGaseF)购买于BioLabs公司；C18柱(固相萃取小柱Sep-PakC18，100mg/1mL)购于Waters公司；固相萃取小柱多孔石墨碳柱(150mg/4mL)购于AlltechAssociates公司；LC-2010A高效液相色谱仪(HPLC)购买于Shimadzu公司；十二烷基硫酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、NP-40均购于AladdinIndustrialInc公司；色谱纯乙腈购于FisherScientific公司；双蒸水是实验室用自动双重纯水蒸馏器进行制备得到；其它试剂均为分析纯。本专利技术中质谱鉴定使用电喷雾电离线性离子阱质谱(LTQXL，ThermoScientific，USA)检测。ESI-MS参数设置如下：进样量，2μL进样环控制；载样流动相为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大规模分离、纯化制备唾液酸糖肽(SGP)的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取新鲜未受精的鸡蛋黄，经过苯酚处理，离心取上清浓缩后，冻干得唾液酸糖肽粗品；(2)取脱脂棉装填成棉花亲水色谱柱；(3)取步骤(1)得到的唾液酸糖肽粗品配置溶液，加到步骤(2)得到的棉花亲水色谱柱上，并作干燥处理；(4)对步骤(3)得到的棉花亲水色谱柱用浓度75％以上的乙腈水溶液洗脱除盐和杂质；(5)用水将糖肽洗脱，冻干得到唾液酸糖肽的纯品。

【技术特征摘要】
1.一种大规模分离、纯化制备唾液酸糖肽(SGP)的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取新鲜未受精的鸡蛋黄，经过苯酚处理，离心取上清浓缩后，冻干得唾液酸糖肽粗品；(2)取脱脂棉装填成棉花亲水色谱柱；(3)取步骤(1)得到的唾液酸糖肽粗品配置溶液，加到步骤(2)得到的棉花亲水色谱柱上，并作干燥处理；(4)对步骤(3)得到的棉花亲水色谱柱用浓度75％以上的乙腈水溶液洗脱除盐和杂质；(5)用水将糖肽洗脱，冻干得到唾液酸糖肽的纯品。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，将脱脂棉均匀装填后，依次采用纯水和乙腈分别清洗，然后在烘箱里50-60℃烘干，得到棉花亲水色谱柱。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，冻干的唾液酸糖肽...

【专利技术属性】
技术研发人员：王仲孚，韩健利，黄琳娟，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61