一种固定化马铃薯多酚氧化酶及其农残降解应用制造技术

本发明专利技术提供了一种固定化马铃薯多酚氧化酶及其农残降解应用。使用本发明专利技术的固定化多酚氧化酶及降解农产品残留农药污染的方法，在短时间内对农产品残留农药的降解率均达60％以上，能够简单快速有效地去除农产品中的农药残留，不需要进行酶的失活处理，也不需要调整pH值，处理过程简单易操作，且不会产生二次污染。本发明专利技术的固定化多酚氧化酶的制备方法原料来源简单，廉价易得，产量大，固定化效率高、稳定性好。本发明专利技术的固定化马铃薯多酚氧化酶属于食品级，可直接喷洒在农产品表面，或者直接在农产品采摘后的加工过程中添加，对农药的降解效果稳定，对环境具有较强的适应性，应用前景良好。

An Immobilized Potato Polyphenol Oxidase and Its Application in Agricultural Residue Degradation

【技术实现步骤摘要】
一种固定化马铃薯多酚氧化酶及其农残降解应用
本专利技术属于农产品残留农药降解领域，特别涉及一种固定化马铃薯多酚氧化酶及其农残降解应用。
技术介绍
作为一个农业大国，我国农药的使用量居世界首位，高达每年80～100万吨。由于使用的不规范，许多农产品遭受到了严重的农药污染。农药残留超标是威胁食品安全的最主要因素。农产品的残留农药能在人体内长期蓄积，从而引起慢性中毒，诱发各种慢性病。残留的农药甚至还可以通过母体转移到下一代，同时可能致畸、致癌、致突变。农产品采摘后残留农药的降解脱毒对于农产品安全尤为重要，尤其是在食用前的降解脱毒，是保障人们安全食用农产品的“最后屏障”。常用的采后农产品残留农药降解脱毒技术主要包括物理、化学以及生物降解脱毒方法。物理方法包括洗涤、去壳、剥皮、加热以及超声洗涤等；化学方法包括光解、水解以及氧化分解；生物方法是指针对性的微生物菌剂对残留农药的降解脱毒。针对农作物残留农药去除的技术比较多的是将果蔬等农产品收获后采用各种清洗剂或农药分解剂去除残留农药；另外有部分现有技术通过研制各种无害无毒或者低毒农药替代高毒性农药，从而减少有毒农药残留。但是，就总体而言，以上所述方法对残留农药的降解脱毒效率有限，食用的农产品中仍然存在较高的毒害风险，同时所述的化学和微生物方法使用过程复杂，并可能引入新的毒害物，难以推广应用。因此，研发简单高效的产后残留农药降解脱毒方法，是目前我国农产品安全的一个重要补充。多酚氧化酶是一类含铜的氧化还原酶，在自然界中普遍存在。在有氧条件下，多酚氧化酶能催化氧化酚类化合物生成醌，从而达到降解污染物的目的，同时不会产生二次污染。由于利用电子转移将有机污染物转化为水分子，多酚氧化酶催化氧化过程温和，被认为是理想的绿色催化剂。目前，应用多酚氧化酶处理污染物的缺点主要是价格高、酶性质不稳定、受环境影响很大、容易失活，产物无法分离，难以重复利用或连续性使用。与游离酶相比，将酶固定在固态基质上，可提高其高效、专一及温和的酶催化反应特性，同时也可进一步使酶稳定性高、容易回收、可实现连续反应和分批式反应等。常用于固定酶的载体包括ABTS、紫丁香醛、丁香酸甲酯、树脂、陶瓷材料等。但是这些载体存在稳定性差、价格昂贵、可能产生毒性产物等缺点，目前在农药降解方面尚未有应用。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，在于提供固定化马铃薯多酚氧化酶在降解残留农药中的应用，使用本专利技术的固定化多酚氧化酶及降解农产品残留农药污染的方法，能有效降解农产品中的残留农药，使用流程简单，且无二次污染。本专利技术的另一目的提供一种固定化马铃薯多酚氧化酶的制备方法，以壳聚糖为载体，利用化学交联法制备了壳聚糖固定化多酚氧化酶。本专利技术的再一目的在于提供所述的通过所述制备方法制得的固定化马铃薯多酚氧化酶，所述的固定化多酚氧化酶固定化效率高、稳定性好。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：固定化马铃薯多酚氧化酶在降解残留农药中的应用。所述的残留农药是指农产品的残留农药。所述的农药包括但不限于：氯酚类农药、毒死蜱、克百威等。所述的氯酚类农药包括五氯酚、2,4-二氯酚等。所述的应用的具体方法为：将所述的固定化马铃薯多酚氧化酶投加至含有农药的溶液中进行反应。所述的振荡反应优选为在摇床进行。所述的固定化马铃薯多酚氧化酶的投加量优选为5～10U·L-1。所述的农药的浓度优选为5～10mg·L-1。所述溶液优选为pH4～9的缓冲液；所述的缓冲液优选为磷酸盐缓冲液；所述的磷酸盐缓冲液pH优选为pH4～9。所述的反应的温度优选为25～60℃。所述的反应的时间优选为1～6h。一种固定化马铃薯多酚氧化酶的制备方法，包括如下步骤：(1)取壳聚糖，加入的戊二醛溶液，搅拌反应6～24h，低温静置12h，离心、洗涤、干燥；(2)加入磷酸盐缓冲液和马铃薯多酚氧化酶，搅拌反应2～10h，低温静置，洗涤至洗涤液中检测不到多酚氧化酶为止，即得所述的固定化马铃薯多酚氧化酶。步骤(1)中所述的壳聚糖的分子量优选为10～35万，脱乙酰度优选为90％。步骤(1)中所述的干燥优选为冷冻干燥。步骤(1)中所述的壳聚糖的用量优选按每0.1g壳聚糖配比10mL5％的戊二醛溶液计算。步骤(1)中所述的壳聚糖优选先进行纯化，所述的纯化的具体操作步骤为：将壳聚糖溶于浓度为0.5～2％(v/v)的冰醋酸溶液中，调节pH至4.5～5.3，使其产生白色絮状沉淀，离心、洗涤、冷冻干燥后得到纯化的壳聚糖。所述的调节pH优选采用NaOH溶液进行调节；进一步优选采用2mol/LNaOH溶液。步骤(2)中所述的马铃薯多酚氧化酶优选采用磷酸盐-丙酮法制得，具体步骤如下：①马铃薯洗净后在低温下保存，再去皮切成小块，加入磷酸盐缓冲液，高速匀浆，低温离心后取上清液；②在步骤①中的上清液中加入冷丙酮，剧烈搅拌，密封低温浸提；低温离心，取沉淀冷冻干燥，即得所述的马铃薯多酚氧化酶。步骤①中所述的高速匀浆的时间优选为2min。步骤①中所述的高速匀浆优选使用高速匀浆机或高速组织破碎机。步骤①中所述的低温离心的条件优选为在-4℃，9500rpm下离心10min。步骤②所述的冷丙酮优选为-20℃的丙酮。步骤②中所述的剧烈搅拌的时间优选为15min。步骤②中所述的浸提的时间优选为3h。步骤(2)中所述的低温静置的时间优选为至少12h。步骤(2)中所述的搅拌反应的温度优选为20～60℃，进一步优选为25℃。步骤(2)中所述的搅拌反应的时间优选为6h。步骤(2)中所述的磷酸盐缓冲液的pH值优选为4～9；进一步优选为5。步骤(2)中所述的洗涤液优选为磷酸盐缓冲液。通过所述制备方法制得的固定化马铃薯多酚氧化酶。本专利技术中所涉及的酶活性的测定：以每分钟催化氧化0.2mol/L邻苯二酚溶液所需酶量为一个酶活单位(U)；固定化多酚氧化酶用单位质量载体的酶活单位(U/g)表示。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术提供了一种降解农产品残留农药的酶制剂及其使用方法，该酶制剂和方法在短时间内对农产品残留农药的降解率均达60％以上。本专利技术能够简单快速有效的去除农产品中的农药残留，不需要进行酶的失活处理，也不需要调整pH值，处理过程简单易操作，且不会产生二次污染。(2)本专利技术所用的多酚氧化酶廉价易得，广泛存在于植物体的各种器官或组织中，来源简单，廉价易得，产量大。且多酚氧化酶属于食品级，可直接喷洒在农产品表面，或者直接在农产品采摘后的加工过程中添加，且不需要调整原有工艺或添加仪器设备。(3)本专利技术所用的固定化多酚氧化酶性质稳定，酶活性损失小，对农药的降解效果稳定，对环境具有较强的适应性。附图说明图1是本专利技术的固定化多酚氧化酶在25℃下于不同pH(3～8)的缓冲液体系中的酶活结果分析图。图2是本专利技术的固定化多酚氧化酶在pH值为6.0时在不同温度(20～60℃)下的酶活结果分析图。图3是本专利技术的固定化多酚氧化酶分别在室温、4℃和-20℃下保藏一个月的存储稳定性结果分析图。图4是本专利技术的固定化多酚氧化酶在4℃下分别于不同pH缓冲液中的酶活结果分析图。图5是本专利技术的固定化多酚氧化酶在不同温度下(25～60℃)降解五氯酚的结果分析图。图6是本专利技术的固定化多酚氧化酶在pH值分别为4～8的缓冲液体系中降解五氯酚的结果分析图。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.固定化马铃薯多酚氧化酶在降解残留农药中的应用。

【技术特征摘要】
1.固定化马铃薯多酚氧化酶在降解残留农药中的应用。2.根据权利要求1所述的固定化马铃薯多酚氧化酶在降解残留农药中的应用，其特征在于：所述的残留农药是指农产品的残留农药。3.根据权利要求1所述的固定化马铃薯多酚氧化酶在降解残留农药中的应用，其特征在于：所述的农药为氯酚类农药、毒死蜱、克百威。4.根据权利要求1所述的固定化马铃薯多酚氧化酶在降解残留农药中的应用，其特征在于：所述的固定化马铃薯多酚氧化酶的投加量为5～10U·L-1；和/或所述的农药的浓度为5～10mg·L-1。5.根据权利要求1所述的固定化马铃薯多酚氧化酶在降解残留农药中的应用，其特征在于，具体应用方法为：将所述的固定化马铃薯多酚氧化酶投加至含有农药的溶液中进行反应。6.一种固定化马铃薯多酚氧化酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取壳聚糖，加入的戊二醛溶液，搅拌反应6～24h，低温静置12h，离心、洗涤、干燥；(2)加入磷酸盐缓冲液和马铃薯多酚氧化酶，搅拌反应2～10h，低温静置，洗涤至洗涤液中检测不到多酚氧化酶为止，即得所述的固定化马铃薯多酚氧化酶。...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴非，刘承帅，高庭，吕亚辉，李芳柏，
申请(专利权)人：广东省生态环境技术研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44