靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种靶向光热疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂的制备方法，由Cypate脂质体、阿霉素‑牛血清白蛋白（ADM‑BSA）以及透明质酸‑阿霉素（HA‑ADM）组成。Cypate由脂质体包载后化学稳定性明显优于游离Cypate，体外升温效果更强，具有良好的肿瘤靶向性和光热治疗效果。Cypate脂质体的靶向性好，具有较强的光热治疗效果，结合ADM‑BSA和HA‑ADM构成免疫治疗及主动靶向化疗的双重靶向透明质酸‑半抗原免疫制剂，对于深部残余以及转移的肿瘤细胞治疗效果好，可以避免各自治疗上的缺陷，达到协同治疗的目的。

Preparation of Targeted Photothermal Therapy Combined with Immunotherapy Anti-Tumor Compound

【技术实现步骤摘要】
靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂的制备方法本专利技术属于专利技术名称为靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂及其制备方法与应用、申请日为2016年8月19日、申请号为2016106902766专利技术申请的分案申请，属于制备方法部分。
本专利技术属于生物医用材料领域，具体涉及一种靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂及其制备方法与应用。
技术介绍
癌症对于人类的威胁与日俱增，且癌症的复发和转移仍是传统治疗手段仍需面对的问题，因此，寻找更新、更加全面的治疗手段是十分必要的。传统的手术治疗、放射疗法和化学疗法存在可能损伤机体正常组织及其他副作用的缺点，从而限制了其对癌症的治疗效果。近年来，以利用近红外光热转换的光热治疗（photothermaltherapy,PTT）迅速发展为继传统化疗、放疗、手术治疗之后又一新型肿瘤治疗技术。光热治疗的基本原理是利用在肿瘤部位聚集的光热材料，通过激光照射，光热转换产生的高热量，可使肿瘤局部温度升高（42℃以上），从而造成肿瘤细胞损伤，甚至热消融消除肿瘤细胞，达到治疗癌症的目的。由于，光热治疗是基于将光热材料靶向传输到肿瘤部位，然后选择性对肿瘤部位进行激光照射，从而极大地降低了对机体其他正常组织毒副作用使得全身系统毒性极大降低，因此，光热治疗是一种极具发展情景的肿瘤治疗技术。其中，光热材料能否成功靶向肿瘤部位且在肿瘤部位细胞位点上有较强近红外光吸收，并能高效率的实现光热转换是成功实施PTT的关键。目前，被广泛研究的光热材料主要包括无机材料和有机材料。其中，包括主要集中于以金、银、钯等为基础的新型金属纳米粒、以铜为基础的半导体纳米粒材料以及以碳为基础的石墨烯、碳管的无机材料运用于光热治疗时存在很多不可忽略的问题，如金属纳米离子的生物代谢差、在机体内不易消除而可能还存在长期毒性以及碳纳米材料的生物毒性等。而与其相比，含有发色团并且在经红外区域有较强的光吸收的有机光热分子因其良好的生物相容性、光学稳定性、较高的光热转换效率等优势而备受研究者关注。但是，单纯的有机小分子应用于光热治疗仍然存在着一些不可避免的问题，比如化学稳定性差、易发生光漂白以及在体内靶向性差，不能在肿瘤部位较长时间滞留，通过静脉给药后药物很快被代谢清除，不能达到有效的PTT浓度。因此，研究发现将有机光热小分子与其他高分子通过聚集体的形式形成胶束或者泡囊时，可以有效地提高有机小分子的稳定性，以及对肿瘤部位的靶向性。属于碳菁类染料一类的吲哚菁绿（ICG）是由美国食品和药物管理局批准可以用于临床近红外成像的有机光热分子，但由于ICG水溶性差，且稳定性较差，亦会在血中与蛋白结合而降低进入癌细胞的量，从而限制了ICG在光热治疗中的应用。针对ICG的这些缺陷，有研究者设计了一种采用非共价键形成的磷脂聚乙二醇-吲哚菁绿的胶束，可延长吲哚菁绿在肿瘤局部滞留时间，使吲哚菁绿在肿瘤内的富集量明显提高，从而使光热效果更加显著（XZheng，DXing，FZhouetal.Mol.Pharm,2011,8:447~456）。此外，有报道一种由卟啉-磷脂双分子层自组装形成的纳米颗粒（Porphysome），这种纳米颗粒具有广泛可调性吸光系数、结构依赖性的荧光自淬灭特性和独特的光热及光声特性。研究人员利用该纳米粒实现了对淋巴系统的感光成像，并生成了低背景的荧光图像。通过静脉给药的方式在小鼠体内该纳米颗粒具有极好的酶生物降解性，急性毒性极低，有好的生物安全性。进一步的动物试验也表明这种纳米颗粒具有良好的肿瘤靶向性，在激光照射诱导下，可使小鼠的肿瘤因产生光热效应而被清除。Cypate分子中拥有两个羧基，可以同时连接多肽两端形成对酶稳定的环状结构，因此，可有效避免光热试剂在到达靶位之前脱落，提高了稳定性，而且Cypate在近红外区能产生荧光并具有光热效应，故在研究中受到重视。但Cypate的疏水性强，靶向性差，在肿瘤部位滞留时间短，易在体内清除。因此，开发生物相容性好、靶向性好、光热转换效率高的包载光热试剂Cypate脂质体在肿瘤光热治疗上更具应用价值。此外，免疫治疗是近年来备受关注的另一种新型治疗手段。与其他治疗手段不同，免疫治疗的原理是通过激发机体的免疫功能，增强对肿瘤细胞的免疫识别功能来从根本上清除肿瘤细胞。尽管许多研究表明机体中的细胞免疫和体液免疫均对肿瘤细胞产生免疫应答，但由于免疫治疗发挥作用周期长，需要花时间等待才能启动对肿瘤细胞的生长抑制作用，故抑制恶性肿瘤生长和发展的效果不理想。因此，免疫治疗需要联合其他治疗手段来达到抗肿瘤的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂的制备、表征以及联合应用。该复合制剂能利用光热效应治疗实体瘤，并通过启动自身免疫，进一步清除残余的肿瘤细胞，提高抗肿瘤效果，达到预防肿瘤复发和转移的效果。本专利技术主要是一方面通过包载光热材料的脂质体，通过EPR效应，以被动靶向作用传输到肿瘤部位，在近红外光的照射下产生的光热效应，对肿瘤产生实质性损伤，另一方面利用免疫原阿霉素-牛血清白蛋白（ADM-BSA）非特异地激活机体的免疫功能，产生抗ADM多克隆抗体，再应用分子桥透明质酸-阿霉素（HA-ADM），由于HA可特异性地于肿瘤细胞表面的特异性受体结合，可形成“肿瘤细胞—HA-ADM—抗ADM多克隆抗体”复合物，从而增强免疫系统对肿瘤细胞的免疫识别能力，同时未结合的HA-ADM还可以发挥主动靶向化疗作用，从而达到更好的抗肿瘤效果。故本专利技术基于EPR效应、配体-受体、抗原-抗体特异性靶向作用，具有被动靶向、主动靶向和免疫治疗的三重靶向治疗作用的特点，肿瘤复发抑制率从低浓度的20%，提高至高浓度的60%，能够更为高效地治疗癌症。为达到上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂，由Cypate脂质体、ADM-BSA以及HA-ADM组成；Cypate脂质体是一种具有良好近红外光热效应和光热治疗效果的包载光热试剂的脂质体，利用脂质成分形成稳定的类似细胞膜的脂质体结构，包载疏水性有机光热材料Cypate于脂质双分子层中，其粒径为80～200nm，优选100～120nm，包封率高且化学稳定性好，具有良好的光热效应。脂质体可以为磷脂、胆固醇自组装产物形成的给药系统，与Cypate协同性好，能有效提高被包裹药物的稳定性及其靶向性，改善药物的溶解度或延长血液循环时间，通过EPR效应，发挥被动靶向作用，增加药物在肿瘤部位的蓄积，降低对正常组织毒副作用。上述技术方案中，所述ADM-BSA的结构式为：所述HA-ADM的结构式为：。上述靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂的制备方法，包括以下步骤：(1)将磷脂、胆固醇和Cypate置于反应器中，加入有机溶剂，密闭搅拌，得到混合物；水浴下，混合物在搅拌后，超声处理；然后在搅拌条件下加入纯化水，继续水浴搅拌3～8min后，超声处理；再继续搅拌10～20min；然后去除有机溶剂，即得Cypate脂质体；(2)将PBS溶液加入BSA中，得到BSA溶液；将ADM.HCl溶解于PBS和DMF混合溶液中，得到ADM溶液；混合BSA溶液与ADM溶液，然后以3～5滴/min的滴速滴加戊二醛溶液，室温下避光反应；反应完成后于4℃下离心处理，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1) 将磷脂、胆固醇和Cypate置于反应器中，加入有机溶剂，密闭搅拌，得到混合物；水浴下，混合物在搅拌后，超声处理；然后在搅拌条件下加入纯化水，继续水浴搅拌3～8 min后，超声处理；再继续搅拌10～20min；然后去除有机溶剂，即得Cypate脂质体；(2) 将PBS溶液加入BSA中，得到BSA溶液；将ADM

【技术特征摘要】
1.一种靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将磷脂、胆固醇和Cypate置于反应器中，加入有机溶剂，密闭搅拌，得到混合物；水浴下，混合物在搅拌后，超声处理；然后在搅拌条件下加入纯化水，继续水浴搅拌3～8min后，超声处理；再继续搅拌10～20min；然后去除有机溶剂，即得Cypate脂质体；(2)将PBS溶液加入BSA中，得到BSA溶液；将ADM.HCl溶解于PBS和DMF混合溶液中，得到ADM溶液；混合BSA溶液与ADM溶液，然后以3～5滴/min的滴速滴加戊二醛溶液，室温下避光反应；反应完成后于4℃下离心处理，取上清，于4℃下，透析；透析完成后，取出透析液，冻干即为ADM-BSA；(3)将HA加入纯水中，然后加入EDC与NHS，搅拌下，室温避光反应7.5～8.5小时，然后离心处理得到上清；将ADM.HCl溶解于纯化水得到ADM溶液；然后将ADM溶液滴加入上清中，搅拌下，避光反应10～14小时，然后离心处理，取上清进行纯水透析；透析完成后，取出透析液，冻干即为HA-ADM；所述靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂由Cypate脂质体、ADM-BSA以及HA-ADM组成。2.根据权利要求1所述靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂的制备方法，其特征在于：所述磷脂为大豆磷脂或卵磷脂；所述Cypate脂质体的粒径为80～200nm；所述Cypate脂质体中，Cypate位于脂质体双分子层中。3.根据权利要求1所述靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂的制备方法，其特征在于：所述Cypate脂质体中，脂质体为磷脂、胆固醇自组装产物；所述ADM-BSA的结构式为：所述HA-ADM的结构式为：。4.根据权利要求1所述靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，磷脂、胆固醇的质量和与Cypate的质量比为25∶...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨红，刘迪，陈华兵，邓安平，吕小燕，王雪，李明，姚枫枫，付佩，徐新早，徐涛，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32