流感黏膜疫苗组合物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供一种流感黏膜疫苗组合物及其制备方法与应用。该组合物含有抗原融合蛋白，其包含流感病毒抗原及大肠杆菌第二型b型忌热型肠毒素A次单元。该抗原融合蛋白的免疫注射能引发一个体内对抗特定流感病毒的细胞性与体液性免疫反应，包含全身性及黏膜免疫反应，因此保护该个体免于病毒感染。

Composition of influenza mucosal vaccine and its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
流感黏膜疫苗组合物及其制备方法与应用
本专利技术是关于一种疫苗组合物及其制备方法与应用，特别是关于一种利用抗原融合蛋白的流感黏膜疫苗组合物及其制备方法与应用.
技术介绍
流感病毒是属于正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)的核糖核酸(RNA)病毒.可感染人类的流感病毒包含A型(TypeA)、B型(TypeB)、及C型(TyPeC)。A型流感病毒曾造成数次大流行，包括1918年H1N1病毒造成的西班牙流感、1957年H2N2病毒造成的亚洲流感、及2009年H1N1病毒造成的全球性猪流感。可感染禽类的A型流感病毒依所致疾病的严重程度分为高致病性禽流感(highlypathogenicavianinfluenza，HPAI)病毒，例如H5N1病毒，与低致病性禽流感(lowpathogenicavianinfluenza，LPAI)病毒。高致病性禽流感病毒可藉由人类与患病禽类接触而感染人类，在禽类及人类均有高致死率.透过感染人类的下呼吸道及进行复制，高致病性禽流感病毒造成病人肺部损伤及血清中细胞激素失调，最终导致严重疾病.在1997年，H5N1病毒在香港养鸡场引起鸡只大量暴毙，亦造成十多例人类感染.其后，H5N1禽流感亦在全球各地发生，包括亚洲、中东、欧洲以及非洲.为避免流感所造成的重大健康及经济损失，医学相关研究人员着重于研发流感疫苗，包括能在个体引发黏膜免疫反应的黏膜疫苗.黏膜疫苗的施予方式包括鼻腔、舌下、口服、直肠、及阴道注射，其中，鼻腔注射疫苗可产生针对抗原的黏膜与全身性免疫，提供呼吸道对抗外来病原的保护力。然而，鼻腔注射疫苗通常需要佐剂的协助才能引起有效的黏膜免疫力.常见的黏膜疫苗佐剂包含霍乱毒素(choleratoxin，CT)与忌热型肠毒素(heat-labileenterotoxin，LT)、去甲基化二核苷酸(unmethylatedCpGdinucleotides)、单磷酸脂质(monophosphoryllipidA，MPL)、及类铎受体(Toll-likereceptor)刺激物。忌热型肠毒素是一种细菌蛋白质毒素，依其氨基酸序列及对神经节苷脂(gangliosides)的结合力可分为第一型(TypeI)与第二型(TypeII)子家族，而第二型子家族可进一步分类为三个子群，包括第二型a型(TypeIIa)、第二型b型(TypeIIb)、及第二型c型(TypeIIc).忌热型肠毒素由A次单元及B次单元组成，其中A次单元具有二磷酸腺苷-核醣苷化(ADP-ribosylation)活性，而B次单元形成的五聚体(pentamer)可结合至真核细胞表面的醣蛋白，使肠毒素进入细胞.由于忌热型肠毒素A次单元在细胞内的作用会造成肠道内水分吸收减少及引起腹泻，先前技术以忌热型肠毒素作为疫苗佐剂时，通常使用含有A次单元突变体的全毒素(holotoxin)，或使用忌热型肠毒素B次单元的五聚体.关于能否以更简易的方式，例如结合野生型的忌热型肠毒素A次单元与流感病毒抗原为单一融合蛋白，于制备有效的流感黏膜疫苗尚属未知.
技术实现思路
缘此，本专利技术的一目的在提供一种流感黏膜疫苗组合物，包含一抗原融合蛋白，其中该抗原融合蛋白包含一流感病毒抗原及一大肠杆菌第二型b型忌热型肠毒素A次单元(TypeIIbheat-labileenterotoxinAsubunit).本专利技术的另一目的在提供一种抗原融合蛋白用于制备流感黏膜疫苗组合物的用途，其中该抗原融合蛋白包含一流感病毒抗原及一大肠杆菌第二型b型忌热型肠毒素A次单元.在本专利技术的一实施例中，该流感病毒抗原是为一血凝素胞外域(hemagglutininectodomain)；该抗原融合蛋白的N端进一步包含一组氨酸片段；以及该流感黏膜疫苗组合物进一步包含一大肠杆菌第二型b型忌热型肠毒素B次单元，其是与该抗原融合蛋白分离或与该抗原融合蛋白结合。在本专利技术的一实施例中，该流感黏膜疫苗组合物包含约10μg的含有该血凝素胞外域的抗原融合蛋白，其是经由鼻腔施予.在本专利技术的一实施例中，含有该H5型血凝素胞外域的抗原融合蛋白活化类铎受体2/1(Toll-likereceptor2/1，TLR2/1)，且引发T细胞相关免疫反应，例如干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、介白素-4(interleukin-4，IL-4)、介白素-17A(interleukin-17A，IL-17A)、或其任意组合的分泌.本专利技术的又一目的在提供一种前述流感黏膜疫苗组合物的制备方法，包含：制备一抗原融合蛋白，其包含一流感病毒抗原及一大肠杆菌第二型b型忌热型肠毒素A次单元；以及混合该抗原融合蛋白与一药学上可接受的载体以获得该流感黏膜疫苗组合物。在本专利技术的一实施例中，该制备方法进一步包含添加一大肠杆菌第二型b型忌热型肠毒素B次单元至该流感黏膜疫苗组合物.本专利技术的流感黏膜疫苗组合物利用一抗原融合蛋白有效引发一个体内对抗流感病毒抗原的体液性与细胞性免疫反应，包含血液及支气管肺泡黏膜中的流感病毒中和抗体，以及T细胞所分泌的多种调控先天与后天免疫系统的细胞激素.因此，该流感黏膜疫苗组合物能提升个体对抗流感病毒的全身性与黏膜免疫力、预防流感病毒经由呼吸道侵入、及减少病毒感染所造成的伤害甚至死亡。以下将配合图式进一步说明本专利技术的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本专利技术的专利技术特点及应用，而非以限定本专利技术的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本专利技术的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本专利技术的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。附图说明图1A显示本专利技术的一实施例的包含一H5型血凝素胞外域(本文中简称H5HA)与一大肠杆菌第二型b型忌热型肠毒素A次单元(本文中简称LTIIb-A)的H5HA-LTIIb-A融合蛋白的建构示意图；该H5HA-LTIIb-A融合蛋白包含一位于N端的组氨酸片段；图1B显示包含一位于C端的组氨酸片段的H5HA-LTIIb-A融合蛋白的建构示意图；图1C是以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺胶体电泳(SDS-PAGE)分析H5HA-LTIIb-A融合蛋白及H5HA重组蛋白；图1D是使用抗H5型血凝素抗体以西方墨点法分析H5HA-LTIIb-A融合蛋白及H5HA重组蛋白；图1E是使用抗H5型血凝素抗体以西方墨点法分析包含N端组氨酸片段的H5HA-LTIIb-A融合蛋白(a、b)及包含C端组氨酸片段的H5HA-LTIIb-A融合蛋白(c、d)；图中a、c所代表的H5HA-LTIIb-A融合蛋白是取自Sf9昆虫细胞表现蛋白质48小时后的细胞培养基；b、d所代表的H5HA-LTIIb-A融合蛋白是取自Sf9昆虫细胞表现蛋白质72小时后的细胞培养基；图1F是以西方墨点法比较抗组氨酸片段抗体与包含N端组氨酸片段的H5HA-LTIIb-A融合蛋白(a、b)或包含C端组氨酸片段的H5HA-LTIIb-A融合蛋白(c、d)的结合力；图中a、c所代表的H5HA-LTIIb-A融合蛋白是取自Sf9昆虫细胞表现蛋白质48小时后的细胞培养基；b、d所代表的H5HA-LTIIb-A融合蛋白是取自Sf9昆虫细胞表现蛋白质72小时后的细胞培养基；图2A是以红血球凝集试验比较H5HA重组蛋白及H5HA-LTIIb-A融合蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种流感黏膜疫苗组合物，包含抗原融合蛋白，其中该抗原融合蛋白包含流感病毒抗原及大肠杆菌第二型b型忌热型肠毒素A次单元。

【技术特征摘要】
1.一种流感黏膜疫苗组合物，包含抗原融合蛋白，其中该抗原融合蛋白包含流感病毒抗原及大肠杆菌第二型b型忌热型肠毒素A次单元。2.根据权利要求1所述的流感黏膜疫苗组合物，其特征在于，所述流感病毒抗原是血凝素胞外域。3.根据权利要求1所述的流感黏膜疫苗组合物，其特征在于，所述抗原融合蛋白的N端进一步包含一组氨酸片段。4.根据权利要求1～3任一项所述的流感黏膜疫苗组合物，其特征在于，进一步包含一大肠杆菌第二型b型忌热型肠毒素B次单元。5.根据权利要求2所述的流感黏膜疫苗组合物，特征在于，包含至少10μg的该抗原融合蛋白。6.一种抗原融合蛋白用于制备流感黏膜疫苗组合物的用途，其中该抗原融合蛋白包含一流感病毒抗原及一大肠杆菌第二型b型忌热型肠毒素A次单元。7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述流感病毒抗原是为一血凝素胞外域。8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述抗原融合蛋白的N端进一步包含一组氨酸片段。9.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述抗原融合蛋白活化类铎受体2/1。10.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴夙钦，林师纬，唐铭甫，陈廷轩，
申请(专利权)人：吴夙钦，
类型：发明
国别省市：中国台湾,71