含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物及其合成和应用制造技术

本发明专利技术设计合成了含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物，其是以线性两亲性α‑螺旋天然抗菌肽Anoplin为模板，将D型氨基酸替换增强酶解稳定性和对替换后D型氨基酸侧链进行脂肪酸修饰增强抗耐药菌活性的策略相结合，得到的一类全新结构的含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物Ano‑D4,7‑4Cn和Ano‑D4,7‑7Cn，n＝4‑16。体外抑菌实验、PI染色法流式细胞术实验和酶解稳定性实验均表明，本发明专利技术含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物具有强抗耐药菌活性和高酶解稳定性；相比于传统抗生素，本发明专利技术得到的新型抗菌肽类似物在临床抗菌药物的开发方面具有很好的应用前景。

Side Chain Fatty Acids Modified Antimicrobial Peptide Analogues Containing D-Amino Acids and Their Synthesis and Application

【技术实现步骤摘要】
含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物及其合成和应用
本专利技术涉及生物化学
，涉及一类全新结构的含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物及其合成和应用，特别涉及一类具有强抗耐药菌活性和高酶解稳定性的含D型氨基酸侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物及其合成和应用。
技术介绍
近年来，由于传统抗生素在临床用药中的滥用，导致耐药菌株，即“超级细菌”的不断出现，该“超级细菌”对大多数或所有可用的抗生素均表现出耐受性(HealthEcon.1996May-Jun；5(3):217-26)。多粘菌素B和多粘菌素E(又称粘菌素)作为阳离子肽类抗菌药，在20世纪60年代得到广泛应用，但由于严重的毒性问题，在20世纪70年代其临床应用大大减少。虽然随着20世纪70年代流行的具有多药耐药性的革兰氏阴性细菌的出现，这两种抗菌药物的使用又出现了复苏，成为了最后的抗生素，但不幸的是，多粘菌素耐药的“超级细菌”也相继出现(ExpertRevAntiInfectTher.2012Aug；10(8):917-34；BiomedResInt.2015；2015:679109)。毋庸置疑，一类新抗生素的开发已经变得至关重要(LancetInfectDis.2013Dec；13(12):1057-98)。作为一种具有较大潜力的新型抗生素，抗菌肽(AMPs)，特别是阳离子抗菌肽，由于其具有广谱抗菌活性，且能够快速杀菌，受到了极大关注(Chembiochem.2015Jan19；16(2):242-53)。AMPs通常由多样的生物有机体产生，包括细菌、真菌、植物、昆虫、两栖动物、甲壳类动物、鱼类和哺乳动物(ClinMicrobiolRev.2006Jul；19(3):491-511)。最为重要的，相较于传统抗生素，细菌不易对没有特定作用靶点的抗菌肽产生耐药性。抗菌肽的作用方式通常涉及与细菌胞质膜的非特异性相互作用，使得到达细菌膜中的抗菌肽发生积累，使膜的渗透性增加和屏障功能丧失，最终导致细菌内容物的泄露而死亡(Eur.J.Biochem.2001,268,5589-5600；NatRevMicrobiol.2005Mar；3(3):238-50)。然而，尽管与传统抗生素相比，AMPs能够有望战胜“超级细菌”，但作为理想的抗菌药物，抗菌活性不佳、宿主细胞的毒性、生理条件的不耐受性、酶降解的敏感性，以及由于复杂的设计而导致的高制造成本，限制了AMPs的临床应用。大量研究表明，D型氨基酸的引入，能够有效的避免蛋白酶的降解，提高抗菌肽的酶解稳定性(SciRep.2017Jul31；7(1):6953；ChemBiolDrugDes.2006Feb；67(2):162-73)，但D型氨基酸的引入通常会导致其抗菌活性降低。而脂肪酸作为生物细胞膜磷脂的重要组成部分，具有较高的疏水性，将其引入抗菌肽中，有利于通过增加抗菌肽的疏水性而增强其对细菌细胞膜的亲和力，从而增强其抗菌活性，并且脂肪酸还可以减少蛋白酶的降解，增强抗菌肽的酶解稳定性，延长抗菌肽体内作用时间(BiochemJ，2005，385(Pt1)：135-43；BiophysChem，2015，199：25-33)。
技术实现思路
本专利技术的目的之一：提供一类全新结构的具有强抗耐药菌活性和高酶解稳定性的含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物。本专利技术的目的之二：提供上述抗菌肽类似物在临床抗菌药物开发中的应用。本专利技术的目的之三：提供上述抗菌肽类似物的合成方法。(一)含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物本专利技术含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物，是在母肽Anoplin的部分D型氨基酸替换类似物Ano-D4,7的4位或者7位引入带有侧链保护基Mtt的D型特殊非天然氨基酸Fmoc-D-Lys(Mtt)-OH，然后脱去侧链保护基，对该D型特殊非天然氨基酸的侧链进行不同长度的脂肪酸(Cn，n＝4-16)修饰，得到新型结构的含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物Ano-D4,7-4Cn，Ano-D4,7-7Cn，n＝4-16。结构式分别如下所示：Gly-Leu-Leu-D-Lys(Cn)-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-NH2其中n＝4-16，命名为Ano-D4,7-4Cn；Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys(Cn)-Thr-Leu-Leu-NH2其中n＝4-16，命名为Ano-D4,7-7Cn；本专利技术含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物的合成方法，包括以下工艺步骤：1、Ano-D4,7-4Cn的合成将Fmoc-Leu-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Leu-resin；同法依次缩合反应氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Lys(Mtt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-D-Lys(Mtt)-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-resin，即为Fmoc-Ano-D4,7-4(Mtt)-resin；将上述得到的Fmoc-Ano-D4,7-4(Mtt)-resin，用含有体积分数为1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，得到Ano-D4,7-4(NH2)-resin；分别将脂肪酸、HOBT、HBTU和DIEA于DMF中溶解混匀，并与Ano-D4,7-4(NH2)-resin进行缩合反应，得到Ano-D4,7-4Cn-resin；将Ano-D4,7-4Cn-resin切割、纯化得到抗菌肽类似物Ano-D4,7-4Cn，n＝4-16。2、Ano-D4,7-7Cn的合成将Fmoc-Leu-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Leu-resin；同法依次缩合反应氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-D-Lys(Mtt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys(Mtt)-Thr-Leu-Leu-resin，即为Fmoc-Ano-D4,7-7(Mtt)resin；将上述得到的Fmoc-Ano-D4,7-7(Mtt)-resin，用含有体积分数为1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，得到Ano-D4,7-7(NH2)-resin；分别将脂肪酸、HOBT、HBTU和DIEA于DMF中溶解混匀，并与Ano-D4,7-7(NH2)-resin进行缩合反应，得到Ano-D4,7-7Cn-resin；将Ano-D4,7-7Cn-resin切割、纯化得到抗菌肽类似物Ano-D4,7-7Cn，n＝4-16。以上所述各氨基酸、脂肪酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一类含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物，其特征是，该抗菌肽类似物的结构式为：Gly‑Leu‑Leu‑D‑Lys(Cn)‑Arg‑Ile‑D‑Lys‑Thr‑Leu‑Leu‑NH2Ano‑D4,7‑4Cn，n＝4‑16；或Gly‑Leu‑Leu‑D‑Lys‑Arg‑Ile‑D‑Lys(Cn)‑Thr‑Leu‑Leu‑NH2Ano‑D4,7‑7Cn，n＝4‑16。

【技术特征摘要】
1.一类含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物，其特征是，该抗菌肽类似物的结构式为：Gly-Leu-Leu-D-Lys(Cn)-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-NH2Ano-D4,7-4Cn，n＝4-16；或Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys(Cn)-Thr-Leu-Leu-NH2Ano-D4,7-7Cn，n＝4-16。2.如权利要求1所述的含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物在临床抗菌药物开发中的应用。3.如权利要求1所述的含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物的合成方法，其特征是：采用经典固相合成方法，将带有侧链保护基Mtt的D型特殊非天然氨基酸Fmoc-D-Lys(Mtt)-OH引入Anoplin的部分D型氨基酸替换类似物Ano-D4,7序列的4位或7位，合成Ano-D4,7-4(Mtt)-resin或Ano-D4,7-7(Mtt)-resin；然后脱去侧链保护基，对所述D型特殊非天然氨基酸的侧链进行不同长度的脂肪酸修饰；最后经切割、纯化后得到含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物Ano-D4,7-4Cn或Ano-D4,7-7Cn，其中，n＝4-16。4.如权利要求3所述的含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物的合成方法，其特征是，所述抗菌肽类似物的合成方法具体为：(1)Ano-D4,7-4Cn的合成将Fmoc-Leu-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Leu-resin；同法依次缩合反应氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Lys(Mtt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-D-Lys(Mtt)-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-resin，即为Fmoc-Ano-D4,7-4(Mtt)-resin；将上述得到的Fmoc-Ano-D4,7-4(Mtt)-resin，用含有体积分数1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，得到Ano-D4,7-4(NH2)-resin；分别将脂肪酸、HOBT、HBTU和DIEA于DMF中溶解混匀，并与Ano-D4,7-4(NH2)-resin进行缩合反应，得到Ano-D4,7-4Cn-resin；将Ano-D4,7-4Cn-resin切割、纯化得到抗菌肽类似物Ano-D4,7-4Cn，n＝4-16；(2)Ano-D4,7-7Cn的合成将Fmoc-Leu-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Leu-resin；同法依次缩合反应氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪京满，王锐，钟超，王一杰，
申请(专利权)人：倪京满，王锐，
类型：发明
国别省市：甘肃,62