一种林蛙油抗氧化肽组分的制备方法及其分离方法与用途技术

本发明专利技术提供一种抗氧化肽组分的制备方法及其在口服液体制剂方面的应用。胃蛋白酶/胰蛋白酶分步水解法制备林蛙油抗氧化肽组分的工艺条件为：胃蛋白酶量2.0％、胃蛋白酶酶解时间3.5h、胰蛋白酶量2.0％、胰蛋白酶酶解时间3.0h。该条件下，林蛙油抗氧化肽组分对羟基自由基的清除率为75.57％，得率为63.45％。经超滤系统，截留分子量1kDa～3kDa的肽组分，即得活性最高的林蛙油抗氧化肽组分Ⅳ。该肽组分在乙醇诱导氧化损伤模型鼠体内具有显著的抗氧化作用，可降低丙二醛和蛋白质羰基含量，升高总超氧化物歧化酶活力及谷胱甘肽含量；可用于林蛙油抗氧化肽组分口服液的制备。

Preparation and Separation of Antioxidant Peptide Components from Rana Rana Oil

【技术实现步骤摘要】
一种林蛙油抗氧化肽组分的制备方法及其分离方法与用途
本专利技术属于天然产物制备和应用领域，具体涉及一种林蛙油抗氧化肽组分的制备方法及其分离方法与用途。
技术介绍
对机体而言，自由基是一把“双刃剑”，生理浓度时广泛参与细胞信号转导和生命过程；过量时又能引起线粒体氧化应激，导致衰老及相关疾病的发生。因此，保持细胞内的氧化与抗氧化平衡(氧化还原平衡)对维持健康极为重要。机体自由基以活性氧自由基(Reactiveoxygenspecies,ROS)为主，还包括部分活性氮自由基(Reactivenitrogenspecies,RNS)。ROS主要包括过氧化氢、羟基自由基、超氧阴离子、氢过氧化物等；RNS包括一氧化氮、过硝酸盐、二氧化氮等。机体自身具备清除多余自由基的能力，这主要依赖于内源性自由基清除系统，包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化酶等抗氧化酶和维生素C、维生素E、还原性谷胱甘肽等抗氧化剂。但由于生理水平较低，当受外界干扰致使机体自由基大量过剩时，内源性抗氧酶与抗氧化剂的作用就显得微乎其微。大量自由基直接损伤机体DNA、蛋白质、细胞膜磷脂等，导致细胞老化、免疫力下降、炎症、中枢神经系统、心血管系统等诸多疾病的发生。例如，免疫细胞膜富含多不饱和脂肪酸(Polyunsaturatedfattyacids,PUFAs)，由于共轭双键的存在，PUFAs对自由基非常敏感，极易被还原为饱和脂肪酸，进而破坏免疫细胞结构与功能。因此，外源性补充抗氧化剂可以辅助机体清除多余自由基，减少ROS对正常细胞DNA与免疫细胞膜的直接损伤和/或炎性细胞因子的释放，进而增强机体免疫应答，是治疗多种疾病及延缓衰老的基础。常用的外源性抗氧化剂多为化学合成物，如丁基羟基茴香醚、丁化羟基甲苯，虽抗氧化效果良好，但因其毒副作用，各国政府纷纷强制规定了每日允许摄入量(Acceptabledailyintake,ADI)，目光也逐渐转向天然抗氧化剂，如抗坏血酸、α-生育酚、β-胡萝卜素、黄酮、儿茶素等。研究发现，蕴藏于蛋白质多肽链中的肽类物质同样具有较强抗氧化活性，且活性往往高于母体蛋白质，抗氧化肽作为一类非酶类自由基清除剂的研究正在兴起(MarineDrugs,2017,15(2):1-26；Antioxidants,2016,5(3):1-16)。获取生物活性肽的方法主要包括：(1)从天然生物体提取；(2)胃肠道消化蛋白质过程中产生或体外酶解蛋白质产生；(3)化学合成、酶法合成或重组DNA技术合成等。由于含量低、提取困难，从生物体中提取的活性肽不大可能满足大规模需求。基因组合和化学组合肽库虽给肽类药物及制药工业带来了革命性进展，但目前肽库的构建、筛选及应用尚处起步阶段。酶法制备生物活性肽因其具有生产条件温和、安全性高、价廉且可得到特定活性肽等优点，已成为生产活性肽的主流方法。Díaz等(JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2003,51(8):2365-2370)将利用酪蛋白制备的磷酸肽加入到油/水乳化体系中，发现酪蛋白磷酸肽能延缓油脂氧化腐败过程；Sakanaka等(JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2005,53(2):464-468)采用微生物酶水解法制备酪蛋白酸钙肽，其在β-胡萝卜素漂白实验中显示很强的抗氧化活性，清除超氧阴离子、DPPH自由基、羟基自由基的能力呈良好量效关系；Saiga等(JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2003,51(12):3661-3667)采用木瓜蛋白酶和ActinaseE水解猪肉肌原纤维蛋白，其产物在Fe2+诱导的亚油酸氧化体系中显示出强抗氧化性，且两种酶水解产物在pH7.1比pH5.4显示出更高的抗氧化活性，木瓜蛋白酶水解产物在pH7.0与维生素E的抗氧化能力几乎相同，这些水解产物都能清除DPPH，螯合金属离子；Leng等(FEBSLetters,2005,579(5):1187-1190)研究发现:蛤肽可以激活SOD，通过清除参与肿瘤细胞恶化的ROS抑制人胃腺癌细胞BGC-823的生长和转移；鹰嘴豆多肽CPe通过提高机体抗氧化能力而发挥抗肿瘤作用(食品工业科技,2015,36(2):368-372)。因此，不同酶的组合有望从蛋白链中释放结构与活性各异的生物活性肽。林蛙油(Oviductusranae)，又称哈蟆油、哈士蟆油，雌性成体林蛙输卵管的干制品，是珍贵的传统补益类中药材。《中药大词典》记载：林蛙油具有“补肾益精、润肺养阴”等功效，用于治疗“虚弱、肺痨、咳嗽、吐血、盗汗”等症；《中国药物学》记载：哈蟆油是“润肺、生津、补虚的身体增强剂，是身体衰弱的滋补佳品”；《中国药典》记载：哈蟆油“补肾益精，养阴润肺”。用于病后体弱，神疲乏力，心悸失眠，盗汗，痨嗽咳血。基于传统应用，国家食品药品监督管理总局批准上市的林蛙油保健食品多以增强机体免疫力、抗疲劳、延缓衰老为保健功能。林蛙油富含多种对人体有益的活性成分，如蛋白质、不饱和脂肪酸、磷脂、多糖、维生素、核酸、激素及铁、锰、硒等人体必需的微量元素。林蛙油中蛋白质含量高达50％以上，是主要的活性成分。在前期工作中，我们系统研究了林蛙油蛋白的抗氧化作用，发现：林蛙油蛋白体内抗氧化活性强，而体外弱，推测实际发挥抗氧化作用的物质形式是某些重要的蛋白消化产物(OxidativeMedicineandCellularLongevity,2018,2018:9021371)。因此，模拟蛋白体内消化过程与程序，并结合活性跟踪是发现林蛙油抗氧化肽的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种林蛙油抗氧化肽组分的制备方法及产品应用。相比林蛙油母体蛋白，本专利技术制备的林蛙油抗氧化肽组分分子量小，利于机体吸收；活性高于母体蛋白；去除无活性蛋白成分，减少蛋白滞留肠道所致的腐败，降低有害腐败产物对机体的危害。根据本专利技术的第一个方面，本专利技术提供了一种林蛙油抗氧化肽组分的制备方法，以林蛙油脱脂粉为原料，首先采用胃蛋白酶在酸性条件酶解，然后采用胰蛋白酶在碱性条件下酶解，酶解液经灭菌、离心、冷冻干燥得林蛙油抗氧化肽组分。所述林蛙油抗氧化肽组分的制备方法具体包括如下步骤：称取一定量林蛙油脱脂粉末，置于蒸馏水中静止过夜；用盐酸调pH至1.0～1.5后置于水浴锅孵育5min；加入一定量胃蛋白酶，搅拌使其分散均匀，置于恒温振荡器中于37℃震荡一定时间；胃蛋白酶酶解结束后，用NaOH溶液调节pH至8.0～8.5后置于37℃水浴5min，加入一定量的胰蛋白酶，搅拌使其分散均匀，放入恒温振荡器中振荡酶解一定时间；胰蛋白酶酶解结束后，将酶解液置于95℃～100℃水浴中灭酶10min～15min，冷却后13000r/min离心30min，上清液冷冻干燥后即得林蛙油抗氧化肽组分；优选的，所述胃蛋白酶的加入量为林蛙油脱脂粉末重量的1.0％～3.0％，进一步优选2.0％；优选的，所述胃蛋白酶的酶解时间为1.5h～4h，进一步优选3.5h；优选的，所述胰蛋白酶的加入量为林蛙油脱脂粉末重量的1.0％～3.0％，进一步优选2.0％；优选的，所述胰蛋白酶的酶解时间为1.5h～4h，优选3h本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种林蛙油抗氧化肽组分的制备方法，其特征在于：以林蛙油脱脂粉为原料，首先采用胃蛋白酶在酸性条件酶解，然后采用胰蛋白酶在碱性条件下酶解，酶解液经灭菌、离心、冷冻干燥得林蛙油抗氧化肽组分。

【技术特征摘要】
1.一种林蛙油抗氧化肽组分的制备方法，其特征在于：以林蛙油脱脂粉为原料，首先采用胃蛋白酶在酸性条件酶解，然后采用胰蛋白酶在碱性条件下酶解，酶解液经灭菌、离心、冷冻干燥得林蛙油抗氧化肽组分。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：称取一定量林蛙油脱脂粉末，置于蒸馏水中静止过夜；用盐酸调pH至1.0～1.5后置于水浴锅孵育；加入一定量胃蛋白酶，搅拌使其分散均匀，置于恒温振荡器中于30-40℃震荡一定时间；胃蛋白酶酶解结束后，用NaOH溶液调节pH至8.0～8.5后置于30-40℃水浴处理，加入一定量的胰蛋白酶，搅拌使其分散均匀，放入恒温振荡器中振荡酶解一定时间；胰蛋白酶酶解结束后，将酶解液置于90℃～100℃水浴中灭酶，冷却后离心，上清液冷冻干燥后即得林蛙油抗氧化肽组分。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述胃蛋白酶的加入量为林蛙油脱脂粉末重量的1.0％～3.0％，优选2.0％。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述胃蛋白酶的酶解时间为1.5h～4h，优选3.5h。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述胰蛋白酶的加入量为林蛙油脱脂粉末重量的1.0％～3.0％，优选2.0％。6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述胰蛋白酶的酶解时间为1.5h～4h，优选3h。7.根据权利要求3-6任一项所述的制备方法，其特征在于：所述胃蛋白酶用量为林蛙油脱脂粉末重量的2.0％，胃蛋白酶酶解时间3.5h；胰蛋白酶用量为林蛙油脱脂粉末重量的2.0％，胰蛋白酶酶解时间3.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：张扬，王逸飞，李明珠，刘舒悦，于佳璐，
申请(专利权)人：常熟理工学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32