一种多照明模式的荧光信号测量装置及其测量方法和应用制造方法及图纸

本发明专利技术属于荧光信号测量技术领域，涉及一种多照明模式的荧光信号测量装置，在照明激发光路中对激发光进行调制，通过物镜之后在样品处生成不同相位的激发照明图案，在荧光收集光路中设置高速切换装置，切换样品的荧光图像在光电传感器靶面上的位置，通过多照明激发光路与荧光成像光路的同步运行，在一次曝光后能够同时得到多个子图像，即对应多种照明模式下的荧光信号。本发明专利技术能够实现在多种照明模式下对单分子进行荧光信号测量，并能够提高对单分子的定位精度，可以在同等光子数条件下实现更高的分辨能力。

A Fluorescence Signal Measuring Device with Multiple Illumination Modes and Its Measurement Method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种多照明模式的荧光信号测量装置及其测量方法和应用
本专利技术属于荧光信号测量
，涉及一种多照明模式的荧光信号测量装置及其测量方法和应用。技术背景传统的光学显微镜由于光的衍射现象导致了分辨率极限的存在，一般为侧向200nm左右，轴向500nm左右。而近年来基于单分子定位的超分辨显微成像技术能够突破这种分辨率限制。这种成像技术依赖于对单个分子的荧光信号的精确定位，因此对单分子定位的精度直接影响到分辨能力。通常的定位方式是对荧光图像中的单分子图像进行图像拟合，并对图像的中心进行估计，进而得到单分子的位置。这种方式无法充分利用物镜的数值孔径，从而限制了定位精度的提高。同时，基于图像拟合的定位方式也会受到单分子图像形状的影响，进一步导致定位精度的下降，除此以外单分子在发光时是不连续的，存在闪烁以及漂白的现象，导致定位精度差、成像时间长。因此，解决上述问题对单分子图像具有重要的意义和应用价值。
技术实现思路
为了减少现有多照明模式荧光测量受到样品变化的影响，本专利技术提出了一种多照明模式的荧光信号测量装置及其测量方法和应用，通过将激发光的调制、光源的闭合、不同相位荧光信号在光电传感器靶面的成像进行同步，实现了多种照明模式下对快速变化荧光信号的测量。通过使用不同相位及方向的激发照明图案，实现了对单分子荧光信号测量，并提高了单分子的定位精度。本专利技术的目的是通过下述技术方案实现的。首先，一种多照明模式的荧光信号测量装置，包括多照明激发系统、荧光成像系统和信号控制处理系统；其中多照明激发系统用于生成X和Y方向不同相位的多照明激发图案，对样品进行激发；荧光成像系统用于收集和扫描不同相位激发照明图案激发产生的荧光子图像，使得在一幅荧光图像中包含N幅荧光子图像；信号控制处理系统用于控制多照明激发系统的激发光闭合、调制器件的相位变换和共振扫描振镜的扫描以及各部分顺序、快速的切换；还包括荧光图像的处理。进一步的，所述的多照明激发系统包括激光器，激光器的光路上依次设有声光调制器、第一1/2波片、检偏器、第一电光调制器、第一偏振分光棱镜；光束经过第一偏振分光棱镜分成两个光路即光路A和光路B，光路A依次设有第二1/2波片、第二电光调制器、第一扩束镜、第二偏振分光棱镜；第二偏振分光棱镜分有两个光路：第一光路上依次设有第一反射镜、第三1/2波片、第三反射镜；第二个光路上依次设有第四1/2波片、第二反射镜；两个光路然后均依次通过第四反射镜、第五反射镜；光路B依次设有第五1/2波片、第三电光调制器、第二扩束镜、第三偏振分光棱镜；第三偏振分光棱镜分有两个管理，第一光路上依次设有第六反射镜、第六1/2波片、第七反射镜；第二个光路上依次设有第七1/2波片、第六反射镜；两个光路然后均依次通过第八反射镜；第五反射镜和第五反射镜的反射光路分别进入第四偏振分光棱镜；第四偏振分光棱镜的出光路上设有第一透镜；第一透镜的光路进入荧光成像系统的二向色分光镜。进一步的，所述的荧光成像系统由物镜、二向色分光镜、第二透镜、光阑、第三透镜、第四透镜、共振扫描振镜、第五透镜组、第六透镜组和光电传感器组成；二向色分光镜、物镜、样品在同一光路上；二向色分光镜的分光路上依次设有第二透镜、光阑、第三透镜、第四透镜、共振扫描振镜；共振扫描振镜的另外一光路上依次设有第五透镜组、第六透镜组和光电传感器；其中第五透镜组和第六透镜组各包含六个分透镜，六个分透镜用于不同相位下的荧光信号收集。优选的，所述的激光器的光源为连续、单纵模的光源；各个调制器的转换频率至少1MHZ；共振扫描振镜扫描频率至少4kHz。本专利技术还提供一种多照明模式的荧光信号测量方法，包括以下步骤：(1)光源发出激发光，激发光经过调制器件调制后通过物镜照射在样品处，形成可控的激发照明图案，调制器件控制N种激发照明图案的切换以及激发光的打开和关闭；(2)样品受到第一种激发照明图案激发并发射荧光信号，荧光信号通过物镜收集后汇聚在共振扫描振镜镜面上，经共振扫描振镜快速扫描，通过N组共轭透镜组中的第一组透镜汇聚到光电传感器靶面位置1处，对荧光信号进行积分；然后切换到第二种激发照明图案激发样品并发射荧光信号，荧光信号通过物镜收集后汇聚在共振扫描振镜镜面上，经共振扫描振镜快速扫描，通过N组共轭透镜组中的第二组透镜汇聚到光电传感器靶面位置2处，对荧光信号进行积分；依次循环，激发照明图案切换N次；(3)在光电传感器曝光过程中，重复步骤2若干次，最终在曝光结束得到一幅荧光图像，其中包含N个荧光子图像，然后对荧光信号图像进行处理分析。优选的，当荧光光束处于两组透镜的交界处时，激发光处于关闭状态；当荧光光束完全位于某一组共轭透镜的通光孔径内时，激发光处于打开状态。在一个曝光周期内，需要共振扫描振镜循环扫描若干周期；对于同一激发照明图案，在一个曝光周期内对应的荧光信号在光电传感器靶面的同一部分进行积分，最终曝光结束后在光电传感器上同时得到N个荧光子图像，分别对应N种不同的激发照明图案。曝光周期的意思是指光电传感器接收到足够的信号，可以行成一个清楚的图像。荧光光束聚焦在共振扫描振镜镜面上，并且共振扫描振镜镜面处于共轭透镜组的焦点处。该一种多照明模式的荧光信号测量方法的应用，当照明图案为不同相位的X和Y方向条纹时，该测量方法用于荧光单分子定位测量。当照明图案为不同方向，且每个方向包含不同相位的若干条纹时，该测量方法用于结构光照明显微成像。本专利技术提出了一种多照明模式的荧光信号测量方法和装置，即激发光使用不同相位的照明图案进行激发，同时不同相位的照明图案和光源快速切换，实现不同相位的图像同幅图显示，然后对单分子在不同照明图案下的亮度计算其相对于照明条纹的相位，再通过相位对位置进行解析，从而实现更高的定位精度和更快的成像速度。利用该技术可以实现对单分子在若干不同照明模式下的荧光信号测量，同时将荧光分子自身的漂白等因素的影响降至最低。使用这种方法，结合不同相位的条纹状照明模式，能够实现对于单分子的干涉测量，相比以往的定位方法具有精度高且不受单分子闪烁漂白的影响等优点。本专利技术提供的一种多照明模式的荧光信号测量装置及其测量方法和应用，基于不同相位下照明激发图案激发和时序控制，有效消除单分子亮度闪烁造成的误差、提高了信号信噪比、降低了荧光染料易漂白等影响。本专利技术对比已有技术具有以下显著优点：(1)本测量方法中，对于样品在不同照明激发图案下的荧光信号测量，能够有效消除样品自身变化以及单分子荧光闪烁造成的影响。(2)本测量方法中，基于不同相位下照明激发图案激发，能够显著提高单分子定位精度，同时提高超分辨显微成像的分辨能力。附图说明图1为本专利技术一种多照明模式的荧光信号测量装置的示意图；图2为本专利技术中一种多照明模式的荧光信号测量图像采集流程示意图；图3为本专利技术中一种多照明模式的荧光信号测量图像处理流程示意图；图4为本专利技术中照明激发系统产生的不同方向和相位的激发干涉照明条纹图案；图5为本专利技术中光电传感器靶面示意图；图6为本专利技术中一幅荧光图像中包含六个荧光子图像示意图；图7为本专利技术得到的荧光信号图像和传统荧光信号图像对比示意图；图8为本专利技术得到的荧光信号图像和传统荧光信号图像分辨率对比示意图。其中：1-激光器；2-声光调制器；3-第一1/2波片；4-检偏器；5-第一电光本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多照明模式的荧光信号测量装置，其特征在于，包括多照明激发系统(42)、荧光成像系统(43)和信号控制处理系统(41)；其中多照明激发系统(42)用于生成X和Y方向不同相位的多照明激发图案，对样品进行激发；荧光成像系统(43)用于收集和扫描不同相位激发照明图案激发产生的荧光子图像，使得在一幅荧光图像中包含N幅荧光子图像；信号控制处理系统(41)用于控制多照明激发系统(42)的激发光闭合、调制器件的相位变换和共振扫描振镜的扫描以及各部分顺序、快速的切换；还包括荧光图像的处理。

【技术特征摘要】
1.一种多照明模式的荧光信号测量装置，其特征在于，包括多照明激发系统(42)、荧光成像系统(43)和信号控制处理系统(41)；其中多照明激发系统(42)用于生成X和Y方向不同相位的多照明激发图案，对样品进行激发；荧光成像系统(43)用于收集和扫描不同相位激发照明图案激发产生的荧光子图像，使得在一幅荧光图像中包含N幅荧光子图像；信号控制处理系统(41)用于控制多照明激发系统(42)的激发光闭合、调制器件的相位变换和共振扫描振镜的扫描以及各部分顺序、快速的切换；还包括荧光图像的处理。2.根据权利要求1所述的一种多照明模式的荧光信号测量装置，其特征在于：所述的多照明激发系统(42)包括激光器(1)，激光器(1)的光路上依次设有声光调制器(2)、第一1/2波片(3)、检偏器(4)、第一电光调制器(5)、第一偏振分光棱镜(6)；光束经过第一偏振分光棱镜(6)分成两个光路即光路A和光路B；光路A依次设有第二1/2波片(7)、第二电光调制器(8)、第一扩束镜、第二偏振分光棱镜(10)；第二偏振分光棱镜(10)分有两个光路：第一光路上依次设有第一反射镜(11)、第三1/2波片(12)、第三反射镜(15)；第二个光路上依次设有第四1/2波片(13)、第二反射镜(14)；两个光路然后均依次通过第四反射镜(16)、第五反射镜(17)；光路B依次设有第五1/2波片(18)、第三电光调制器(19)、第二扩束镜(20)、第三偏振分光棱镜(21)；第三偏振分光棱镜(21)分有两个管理，第一光路上依次设有第六反射镜(22)、第六1/2波片(23)、第七反射镜(26)；第二个光路上依次设有第七1/2波片(24)、第六反射镜(25)；两个光路然后均依次通过第八反射镜(27)；第五反射镜(17)和第五反射镜(17)的反射光路分别进入第四偏振分光棱镜(28)；第四偏振分光棱镜(28)的出光路上设有第一透镜(29)；第一透镜(29)的光路进入荧光成像系统(43)的二向色分光镜(30)。3.根据权利要求1所述的一种多照明模式的荧光信号测量装置，其特征在于：所述的荧光成像系统(43)由物镜(31)、二向色分光镜(30)、第二透镜(33)、光阑(34)、第三透镜(35)、第四透镜(36)、共振扫描振镜(37)、第五透镜组(38)、第六透镜组(39)和光电传感器(40)组成；二向色分光镜(30)、物镜(31)、样品(32)在同一光路上；二向色分光镜(30)的分光路上依次设有第二透镜(33)、光阑(34)、第三透镜(35)、第四透镜(36)、共振扫描振镜(37...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷陆生，纪伟，徐涛，付彦辉，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11