检测转基因大豆品系MON87705的PCR引物组合及应用制造技术

本申请公开了一种检测转基因大豆品系MON87705的PCR引物组合及应用。所述引物组合包括特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的引物对，其上游引物如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示。所述引物组合还包括特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的探针，其序列为SEQ ID No.3或其互补序列。所述引物组合在使用微滴式数字PCR方法检测待测样品时，特异性好，灵敏度(检测下限)为PCR扩增的反应体系中DNA模板的浓度0.025ng/μL。本发明专利技术对转基因大豆品系MON87705外源基因成分的定性和定量检测具有十分重要的应用价值。

Combination and Application of PCR Primers for Detecting Transgenic Soybean Line MON87705

【技术实现步骤摘要】
检测转基因大豆品系MON87705的PCR引物组合及应用
本专利技术涉及生物
，具体说是一种检测转基因大豆品系MON87705的PCR引物组合及应用。
技术介绍
转基因作物已经商业化二十余年，2016年时种植面积已达到了1.851亿公顷，超过26个国家种植了转基因作物。转基因大豆作为最早进行商业化应用的转基因植物品种之一，它的种植面积达到了9140万公顷，占转基因作物总量的50％。转基因大豆在美国、巴西和阿根廷有较大种植面积，在国际农产品市场中占有重要的地位。随着转基因大豆在全球范围内大面积的种植与消费，我国面临多种情况与问题：转基因作物可能在生产加工、运输销售等过程中掺杂到非转基因产品中，而且截至目前为止共有10个大豆转基因品系获得我国转基因生物安全证书，其产品也会随着正常的国际贸易流入市场，同时很多消费者也在关注转基因作物的安全性问题，呼吁保证自身知情权和消费权等。这些促使着我国在实现转基因成分的检测基础上，加快实现转基因产品的定量检测，尽快完善转基因产品管理体系。目前，转基因成分定量检测一般采用实时荧光PCR技术，是通过绘制标准物质浓度曲线，通过检测阈值来计算转基因成分含量的，但是在实际应用中局限性很大，最主要的是标准曲线的制备，首先很难做到精准的标准浓度梯度，其次在操作步骤及绘制曲线过程中会不可避免地产生误差，数字PCR就能很好地避免这一点并可以不受扩增效率的影响，实现精准的定量。数字PCR(以下简称dPCR)是一种基于油包水结构实现单分子扩增的PCR方法，能实现不依赖于标准曲线检测拷贝数，利用内参基因与外源基因拷贝数比例来计算转基因成分含量，从而实现高灵敏度的定量。dPCR根据样本分散方式主要有微滴式数字PCR(ddPCR)和芯片式数字PCR(cdPCR)两种。转基因大豆品系MON87705是孟山都公司研发的品质改良抗除草剂复合性状转基因作物。它是利用二元质粒载体PV-GMPQ/HT4404通过农杆菌介导转化常规大豆A3525的分生组织得到的，含有FAD2-1A/FATB1Ab表达抑制盒和cp4-epsps耐除草剂基因。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测转基因大豆品系MON87705的PCR引物组合及应用，所述引物组合具有检测特异性高、灵敏度高等优点，对外源基因成分的定性和定量检测具有十分重要的应用价值。为达到以上目的，本专利技术采取的技术方案是：一种用于检测转基因大豆品系MON87705的PCR引物组合，所述引物组合包括特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的引物对；所述特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的引物对的上游引物如SEQIDNo.1所示，下游引物如SEQIDNo.2所示。所述引物组合可用于基于PCR反应原理的检测中，其中，在一种实施方式中，为了进行相对定量检测，所述引物组合还包括特异检测内参基因Lectin的引物对；优选的，所述特异检测内参基因Lectin的引物对的上游引物如SEQIDNo.4所示，下游引物如SEQIDNo.5所示。在另一种实施方式中，为了进行如实时荧光定量PCR或数字PCR等需要通过检测信号大小的方法检测靶基因数量时，所述引物组合还包括特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的探针；优选的，所述特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的探针的序列为SEQIDNo.3或其互补序列；和/或，所述引物组合还包括特异检测内参基因Lectin的探针；优选的，所述特异检测内参基因Lectin的探针的序列为SEQIDNo.6或其互补序列；优选的，所述探针为Taqman探针；更优选的，所述探针的5’端使用报告荧光基团VIC、FAM、HEX、TexasRed或CY5进行修饰，所述探针的3’端使用淬灭基团BHQ1、BHQ2、BHQ3、或TAMRA进行修饰。本专利技术保护以上任一所述的引物组合在检测转基因大豆品系MON87705外源基因中的应用；所述检测可为定性检测，即检测待测样品中是否存在转基因大豆品系MON87705外源基因；也可为定量检测，即检测待测样品中转基因大豆品系MON87705外源基因的绝对拷贝数；所述定性或定量检测的方法为普通PCR、荧光定量PCR或数字PCR，优选为数字PCR，更优选为微滴式数字PCR。本专利技术还提供一种用于检测转基因大豆品系MON87705外源基因的PCR试剂盒，所述试剂盒包括以上任一所述引物组合；优选的，所述试剂盒中还包括微滴PCR反应预混液、微滴生成油、微滴分析油、微滴生成卡槽、和/或微滴生成卡槽胶垫。本专利技术还提供一种检测转基因大豆品系MON87705外源基因的方法，包括如下步骤：S1、采集待测样品的基因组DNA；S2、以步骤S1的DNA为模板，使用以上任一所述引物组合或所述试剂盒进行PCR扩增；S3、根据步骤S2的结果，判断待测样品中是否含有转基因大豆品系MON87705外源基因或确定待测样品中转基因大豆品系MON87705外源基因的拷贝数；所述PCR为普通PCR、荧光定量PCR或数字PCR，优选为数字PCR，更优选为微滴式数字PCR。在上述方法中，所述PCR扩增的反应体系中DNA模板的浓度为0.025—5ng/μL，优选1.25—5ng/μL。在上述方法中，所述PCR扩增的反应体系中，所述特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的引物对的上游引物和下游引物的浓度分别为0.5μmol/L；所述特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的探针的浓度为0.25μmol/L；所述特异检测内参基因Lectin的探针的浓度为0.25μmol/L。在上述方法中，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性10min；94℃变性15s，57℃退火60s，共39个循环；扩增结束后进行98℃、10min的热失活。本专利技术保护以上任一所述引物组合、所述试剂盒或以上任一所述方法在制备转基因大豆品系MON87705检测用标准品中的应用。本专利技术的有益效果如下：本专利技术所述的检测转基因大豆品系MON87705的PCR引物组合，在使用微滴式数字PCR方法检测待测样品时，特异性好，灵敏度(检测下限)为PCR扩增的反应体系中DNA模板的浓度0.025ng/μL。本专利技术对转基因大豆品系MON87705外源基因成分的定性和定量检测具有十分重要的应用价值。附图说明图1为不同外源基因引物对及其探针的ddPCR一维反应热点图，其中，粗横线为荧光阈值限，粗横线上方的点为阳性点，粗横线下方的点为阴性点；G05、G06、G08和G09分别为外源基因引物对B1-F/R、B2-F/R、B3-F/R和B4-F/R及其对应探针的检测结果。图2为引物组合特异性检测的ddPCR一维反应热点图，其中，A01和A02为检测转基因大豆品系MON87705标准品的结果，B01和B02为检测转基因大豆品系MON87701标准品的结果，C01和C02为检测转基因大豆品系MON87769标准品的结果，D01和D02为检测转基因大豆品系DP356043标准品的结果，E01和E02为检测转基因大豆品系DAS68416标准品的结果。图3为MON87705转基因成分定量结果的线性拟合标准曲线。图4为数字PCR一维反应热点图，其中，粗横线为荧光阈值限，粗横线上方的点为阳性点，粗横线下方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测转基因大豆品系MON87705的PCR引物组合，其特征在于，所述引物组合包括特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的引物对；所述特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的引物对的上游引物如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测转基因大豆品系MON87705的PCR引物组合，其特征在于，所述引物组合包括特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的引物对；所述特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的引物对的上游引物如SEQIDNo.1所示，下游引物如SEQIDNo.2所示。2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合还包括特异检测内参基因Lectin的引物对；优选的，所述特异检测内参基因Lectin的引物对的上游引物如SEQIDNo.4所示，下游引物如SEQIDNo.5所示。3.如权利要求1或2所述的引物组合，其特征在于：所述引物组合还包括特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的探针；优选的，所述特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的探针的序列为SEQIDNo.3或其互补序列；和/或，所述引物组合还包括特异检测内参基因Lectin的探针；优选的，所述特异检测内参基因Lectin的探针的序列为SEQIDNo.6或其互补序列；优选的，所述探针为Taqman探针；更优选的，所述探针的5’端使用报告荧光基团VIC、FAM、HEX、TexasRed或CY5进行修饰，所述探针的3’端使用淬灭基团BHQ1、BHQ2、BHQ3、或TAMRA进行修饰。4.权利要求1—3中任一所述的引物组合在检测转基因大豆品系MON87705外源基因中的应用；优选的，所述检测的方法为普通PCR、荧光定量PCR或数字PCR，优选为数字PCR，更优选为微滴式数字PCR。5.一种用于检测转基因大豆品系MON87705外...

【专利技术属性】
技术研发人员：付伟，刘晓，朱鹏宇，朱水芳，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11