一种鉴定津研快绿1号小白菜种子纯度的引物及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鉴定津研快绿1号小白菜种子纯度的SSR标记引物，它为SEQ ID NO:1‑2所示的核苷酸序列。本发明专利技术进一步公开了利用SSR标记引物鉴定津研快绿1号小白菜杂交种种子纯度的方法。本发明专利技术提供的特异性引物及方法，可以在实验室3‑5小时完成津研快绿1号杂交种的种子纯度鉴定，具有快速、稳定、不受环境影响等优点，能替代传统田间种子纯度鉴定方法，有利于津研快绿1号种子高效准确的质量控制。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定津研快绿1号小白菜种子纯度的引物及应用
本专利技术属于生物
，涉及鉴定津研快绿1号小白菜种子纯度的SSR标记引物及应用。
技术介绍
小白菜（BrassicarapaL.ssp.chinensis）属十字花科芸薹属，属于不结球白菜，其含有丰富的蛋白质、糖类、膳食纤维、胡萝卜素、维生素和钙、磷、铁等。与传统的大白菜相比，小白菜生长周期短，几乎一年四季都可种植、上市，其纤维含量少，质地柔嫩，味甘而清香，从幼苗到成株皆可食用，是我国栽培面积最大，分布最广的大众化蔬菜之一，在保证我国蔬菜供应中起重要作用。优质品种是保证小白菜正常生产和供应的关键，种子纯度是品种优劣的重要判定标准。目前，一般采用小白菜自交不亲和材料生产杂交种，在制种过程中，存在母本材料偶尔自交、外来花粉混入或其他原因导致的杂交种纯度降低的现象，严重影响了种子的质量，给育种企业和农民造成了很大损失。所以，在种子销售之前都必须鉴定种子的纯度，以保证种子的质量。传统的种子纯度鉴定方法，采用在田间直接观察作物特定生长发育阶段的特性和一致性，存在周期较长、工作量大且易受环境影响等因素，经常与种子的销售旺季相冲突，造成种子库存积压。近年来，随着分子生物学的发展，基于SSR、InDel等分子标记的检测技术，具有标记数目多、周期短、重复性高、不受环境影响等优点，在种子纯度鉴定方面的应用越来越广泛。津研快绿1号是天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所育成的小白菜品种之一，植株较直立，叶色浅绿，叶长倒卵形，叶全缘，无茸毛，高抗花叶病毒病和软腐病、抗霜霉病，耐热耐湿，生育期约30天，适宜夏、秋季种植及南方冬季种植。该品种之前一直采用田间直接观察生长性状的方法检测种子纯度，随着播种面积和种子需求量的增加，需要一种快速检测方法检测该品种的种子纯度。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测津研快绿1号小白菜杂交种种子纯度的引物序列及应用。为实现该目的，本专利技术采用以下技术方案：一种鉴定津研快绿1号小白菜种子纯度的SSR标记引物，其特征在于它为SEQIDNO:1-2所示的核苷酸序列：TCCTCGAGTTTCGCTTCATATCCTGSEQIDNO:1AGTCTGGAAACTTACATGGAAGTAAAATACAAAACSEQIDNO:2。本专利技术进一步公开了所述的SSR标记引物鉴定津研快绿1号小白菜杂交种的种子纯度的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）提取津研快绿1号杂交种待测样品的基因组DNA；（2）以上述样品的基因组DNA为模板，以SSR标记引物为特异性引物进行PCR扩增；PCR反应采用10µL体系包括：10×PCRBuffer，1.0µL；2.5mMdNTP，0.2µL；10µmol·L-1primers，0.4µL；5U·µL-1Taq，0.2µL；50ng·µL-1DNA，1.5µL；ddH2O，6.7µL；PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min；所述的SSR标记引物为：TCCTCGAGTTTCGCTTCATATCCTGSEQIDNO:1AGTCTGGAAACTTACATGGAAGTAAAATACAAAACSEQIDNO:2；（3）将上述PCR的扩增产物，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染；（4）统计上述银染结果：所检测津研快绿1号杂交种纯度（%）=（检测种子总粒数-非杂交种粒数）/（检测种子总粒数）×100%。本专利技术更进一步公开了上述鉴定方法在用于快速准确鉴定津研快绿1号小白菜种子纯度方面的应用。实验结果显示：本专利技术可以快速、准确地鉴定津研快绿1号小白菜种子的纯度。本专利技术主要解决了津研快绿1号种子纯度传统田间鉴定方法用时长、易受环境影响等缺点，主要的难点在于开发津研快绿1号父本与母本间具有多态性、稳定性好、易区分的SSR分子标记引物。本专利技术公开的鉴定津研快绿1号小白菜种子纯度的SSR标记引物与现有技术相比，所具有的积极效果在于：本专利技术提供的特异性引物及方法，可以在实验室3-5小时完成津研快绿1号杂交种的种子纯度鉴定，具有快速、稳定、不受环境影响等优点，能替代传统田间种子纯度鉴定方法，有利于津研快绿1号种子高效准确的质量控制。附图说明图1为SSR引物A09-17在津研快绿1号父本、母本及杂交种样品的电泳图；M表示DNAMarker，1-3为津研快绿1号父本的三个重复材料，4-5为津研快绿1号母本材料的三个重复材料，7-9为津研快绿1号杂交种的三个重复材料；图2为SSR引物检测津研快绿1号杂交种46个样品纯度的电泳图；M表示DNAMarker，P1表示父本材料，P2表示母本材料，其余为待测的杂交种材料，其中三角所在位置表示该材料为非杂交种材料，其余都为杂交种材料。具体实施方式除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。以下实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的仪器、材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。所用到的父本材料JL520、母本材料JA714可向天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所大白菜课题组索取，津研快绿1号杂交种有市售。实施例1一、材料父本材料、母本材料、及津研快绿1号杂交种各3个单株，用于引物筛选。随机取制种基地6家签约农户生产的津研快绿1号杂交种各92粒种子，进行种子纯度鉴定。二、SSR引物的筛选根据大白菜基因组重测序数据，设计多对引物，对津研快绿1号、母本材料、父本材料进行多态性检测，筛选出具有共显性差异的引物对A09-17，序列如下:F:5’-TCCTCGAGTTTCGCTTCATATCCTG-3’(SEQIDNO:1)R:5’-AGTCTGGAAACTTACATGGAAGTAAAATACAAAAC-3’(SEQIDNO:2)该标记重复性好、条带清晰，以该引物为特异性引物，以待测样品的基因组DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳分离并染色检测，结果显示：在父本材料中可扩增出122bp的特异性条带，在母本材料中能够扩增出154bp的特异性条带，津研快绿1号杂交种材料中同时扩增出154bp和122bp的特异性条带。三、基因组DNA的提取及PCR扩增（1）用CTAB法提取父本材料、母本材料及津研快绿1号杂交种各3个单株的基因组DNA，作为模板用于引物筛选；制种基地6家签约农户生产的津研快绿1号杂交种在田间播种，正常管理，各92株，进行统一编号，提取基因组DNA，用于种子纯度鉴定。具体步骤为：取幼嫩叶片0.2g入1.5mL离心管中，加50μL2%CTAB提取缓冲液，研磨，后补齐至400μL，65℃水浴30min；加入400μL氯仿：异戊醇（24:1），轻摇5min。12000rpm离心5min；取上清200μL，加入预冷的异丙醇200μL混匀，-20℃放置20min；12000rpm离心10min；弃上清，加入150μL预冷乙醇，轻轻混匀洗净，10,000rp本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定津研快绿1号小白菜种子纯度的SSR标记引物，其特征在于它为SEQ ID NO:1‑2所示的核苷酸序列：TCCTCGAGTTTCGCTTCATATCCTG                  SEQ ID NO:1AGTCTGGAAACTTACATGGAAGTAAAATACAAAAC        SEQ ID NO:2。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定津研快绿1号小白菜种子纯度的SSR标记引物，其特征在于它为SEQIDNO:1-2所示的核苷酸序列：TCCTCGAGTTTCGCTTCATATCCTGSEQIDNO:1AGTCTGGAAACTTACATGGAAGTAAAATACAAAACSEQIDNO:2。2.一种采用权利要求1所述的SSR标记引物鉴定津研快绿1号小白菜杂交种的种子纯度的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）提取津研快绿1号杂交种待测样品的基因组DNA；（2）以上述样品的基因组DNA为模板，以SSR标记引物为特异性引物进行PCR扩增；PCR反应采用10µL体系包括：10×PCRBuffer，1.0µL；2.5mMdNTP，0.2µL；10µmol·L-1primers，0.4µL；5...

【专利技术属性】
技术研发人员：王超楠，张红，华德平，黄志银，李梅，范伟强，张斌，刘晓晖，
申请(专利权)人：天津科润农业科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12