检测橡胶树褐根病病菌的LAMP引物组合物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测橡胶树褐根病病菌的LAMP引物组合物及其应用。本发明专利技术的检测橡胶树褐根病病菌的LAMP引物组合物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。基于该LAMP引物组合物建立的橡胶树褐根病病菌可视化检测方法，经过LAMP恒温扩增后显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形条带。本发明专利技术的LAMP引物组合物及其检测方法能在田间实现橡胶树褐根病病菌的快速、灵敏、准确检测和鉴定，为橡胶树褐根病的早期预警及防控提供可靠的技术手段和理论依据。

LAMP Primer Composition for Detecting Brown Root Disease of Rubber Tree and Its Application

【技术实现步骤摘要】
检测橡胶树褐根病病菌的LAMP引物组合物及其应用
本专利技术涉及农作物病害检测鉴定技术和分子生物学
，具体涉及一种用于检测橡胶树褐根病病菌(Phellinusnoxius)的LAMP引物组合物、试剂盒和应用，可实现橡胶树褐根病的早期诊断、病菌的监测和鉴定。
技术介绍
天然橡胶是全球重要的工业原料和战略物资，是国防工业和高端装备生产中不可替代的重要原料，在我国主要分布于云南、海南、广东、广西、福建、台湾等地区。我国天然橡胶的种植面积和产量均居世界第五位，也是全球最大的消费国和进口国。褐根病是橡胶生长中一种毁灭性的土传病害，在世界各植胶区严重以及普遍发生，是限制我国橡胶单产提高的重要生物因子。该病害主要通过根系接触传染，染病植株因根部腐朽生长衰弱、树叶变黄、枯萎脱落，从黄化到枯死通常仅需半月至三个月。对天然橡胶产业造成较大的经济损失。由有害层孔菌[Phellinusnoxius(Corner)CornerG.H.Cunn.]引起的橡胶树褐根病是天然橡胶生产中危害最为严重的根部病害，发生严重的林段发病率达10％以上，且死树率高。褐根病发生早期不易被发现，待其出现病症时，病菌危害已十分严重，防治十分困难。因此，建立快速、准确、灵敏、高效的检测技术，及时检测出树体中的病原菌并采取科学有效的防治措施，对控制橡胶树褐根病的传播蔓延具有重要作用。目前对橡胶树褐根病菌的检测以病症识别及组织分离病原菌为主，但传统方法往往专业性强、耗时长、灵敏度低，难以达到快速诊断和检测的目的；利用分子生物学技术检测该病病原菌方法有常规PCR方法(梁艳琼等，2016)，虽然能够快速、准确检测出病原，但需要PCR仪、电泳和凝胶成像系统等昂贵的专业仪器设备和分子生物学专业的实验人员操作，不适宜在基层以及田间大规模应用，使田间病情无法及时、准确的检测及有效防控。LAMP是一种在恒温条件下，快速、高效、特异的扩增靶序列的核酸扩增技术(Notomietal.,2000)，该技术在短时间内可实现大量扩增，60℃～65℃恒温反应30min～60min内便能达到109～1010倍的扩增，在反应产物中添加荧光染料通过颜色变化来判断扩增结果，其特异性和灵敏性高，且不需要昂贵仪器设备，仅需在恒温水浴锅内即可完成，具有操作快速简便、特异性强、灵敏度高、检测成本低等特性。目前该技术已在植保等诸多领域得到广泛应用，极大提高了鉴定效率和准确率。迄今，还未见应用LAMP技术对橡胶树褐根病病原菌进行检测的报道，因此建立高效、快速的橡胶树褐根病菌LAMP检测技术可为橡胶树褐根病的发生和防治提供重要的技术手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服传统诊断方法的繁琐、耗时长、准确度低和经验要求高以及PCR检测技术所需昂贵仪器设备、不便在田间直接检测等问题，提供一种橡胶树褐根病病菌LAMP检测引物以及简便、快捷、灵敏、特异的可视化检测方法。本专利技术另一目的在于提供上述快速检测方法在橡胶树褐根病的早期诊断、病菌的监测和鉴定中的应用。本专利技术的第一方面提供了一种用于橡胶树褐根病病菌LAMP快速检测的引物组合物。一种用于橡胶树褐根病病菌(Phellinusnoxius)LAMP快速检测的引物组合物，由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP组成，各引物核苷酸序列为：F3：5’-TTTGAGTGTCATGTTAATCTCA-3’(序列表中序列1)；B3：5’-TCAAAGTTAAGTGTTTGTCTCAT-3’(序列表中序列2)；FIP：5’-CTAATGTATTCAAGAGAAGCCGACTCTAAAAAGTGTTGATATTGGACTTG-3’(序列表中序列3)；BIP：5’-CTGGGCTTTTGCTCGAGTAATTGGACGATTAGAAGCAGACTCT-3’(序列表中序列4)。本专利技术的第二个方面在于，提供一种可以快速检测橡胶树褐根病病菌(Phellinusnoxius)的LAMP检测试剂盒。本专利技术提供的可以快速检测橡胶树褐根病病菌的LAMP试剂盒包含所述的引物组合物。即包含正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP。所述引物组的各引物可分别单独包装。本专利技术的第三个方面是提供如第一个方面所述的引物组合物或本专利技术第二个方面所述的试剂盒在快速检测引起橡胶树褐根病病菌(Phellinusnoxius)的应用。本专利技术的第四个方面是提供一种用于快速检测橡胶树褐根病病菌(Phellinusnoxius)的方法，该方法包括使用本专利技术第一个方面所述的引物组合物或本专利技术第二个方面所述的试剂盒中的引物组进行扩增的步骤。其包括：(1)提取待测样品DNA；(2)以提取DNA为模板，利用第一个方面所述的LAMP引物组合物或本专利技术第二个方面所述的试剂盒进行LAMP扩增；(3)LAMP扩增反应结束，按照以下任意三种方式观察结果：1)通过肉眼直接观察反应液颜色是否为白色浑浊，有白色浑浊即为阳性，表明含有橡胶树褐根病病菌，否则为阴性，不含有橡胶树褐根病病菌；2)取扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，观察扩增结果。若电泳图谱有梯状条带为阳性，表明含有橡胶树褐根病病菌；否则为阴性；3)向扩增产物中加入1uL荧光显色剂SYBRGreenI，观察颜色变化。若LAMP扩增产物由橙色变为绿色为阳性，表明含有橡胶树褐根病病菌；颜色保持橙色不变，为阴性。本专利技术中，将所述待测样品的基因组进行PCR扩增的条件不受特别限制。其中，步骤(2)所述LAMP扩增的反应体系为25μL，包括2.5μmol/L的F3和B3各2μL；20mmol/L的FIP和BIP各1.5μL；10mmol/LdNTPs3.5μL；25mmol/LMgSO46μL；10mol/L甜菜碱2μL；10×Bst-DNApolymerasebuffer2.5μL；8UBst3.0DNApolymerase1μL；10～100ng/μL的DNA模板1μL；ddH2O2μL。步骤(2)所述LAMP扩增的反应条件可在60℃～65℃进行。所述LAMP扩增的反应条件优选为：63℃保温60min。所述的显色剂为SYBRGreenI。本专利技术提供了用于橡胶树褐根病病菌(Phellinusnoxius)LAMP检测的特异性引物组F3、B3、FIP、BIP及含有该引物组的LAMP试剂盒。本专利技术可快速准确地对橡胶树褐根病病菌(Phellinusnoxius)引起的多种林木病害进行分子鉴定和病害的早期诊断，对橡胶树褐根病的监测和防治具有重要意义。本专利技术提供的利用本专利技术的引物组合物快速检测橡胶树褐根病病菌(Phellinusnoxius)的分子生物学方法，具有简便高效、特异性强、灵敏度高和检测结果易观察等特点，与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：1.简便快捷：本专利技术检测方法通过恒温水浴锅或有稳定热源的设备就能完成，通过扩增产物的颜色变化就可判断结果，无需依赖热循环PCR仪以及凝胶成像仪等昂贵仪器设备；2.效率高：本专利技术检测方法检测时间短，整个检测过程可在1.5h内完成，大幅缩短了检测时间，提高了检测效率。而普通PCR扩增时间较长，通常需要3h～4h才能完成。3.特异性强：本专利技术检测方法针对靶基因的6个独立区域设计出对橡胶树褐根病病菌(Phe本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)的LAMP引物组合物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。

【技术特征摘要】
1.检测橡胶树褐根病病菌(Phellinusnoxius)的LAMP引物组合物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。2.一种检测橡胶树褐根病病菌(Phellinusnoxius)的试剂盒，包括权利要求1所述的LAMP引物组合物。3.根据权利要求2所示的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括PCR反应试剂。4.一种橡胶树褐根病病菌(Phellinusnoxius)LAMP检测方法，其特征在于：利用权利要求1所述的橡胶树褐根病病菌LAMP引物组合物进行LAMP反应，LAMP反应体系为25μL，包括2.5μmol/L的序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA各2μL；20mmol/L的序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA各1.5μL；10mmol/LdNTPs3.5μL；25mmol/LMgSO46μL；10mol/L甜菜碱2μL；10×Bst-DNApolymerasebuffer2.5μL；8UBst3.0DNApolymerase1μL；10～100ng/μL的DNA模板1μL；ddH2O2μL。5.根据权利要求4所述的LAMP检测方法，其特征在于：所述LAMP反应条件为60℃～65℃温育60min，85℃灭活8min，终止反应。6.一种橡胶树褐根病病菌(Phellinus...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺春萍，董文敏，吴伟怀，梁艳琼，李锐，易克贤，谢立，黄兴，习金根，郑金龙，陆英，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46