一种毕赤酵母中异源表达内切葡聚糖酶EGⅡ,EGⅣ,EGⅤ的构建方法技术

技术编号:21538000 阅读:29 留言:0更新日期:2019-07-06 18:36
本发明专利技术的目的在于构建一种异源表达EGⅡ,EGⅣ,EGⅤ蛋白的重组毕赤酵母,具体步骤如:(1)里氏木霉RNA和CDNA的获得:固体诱导培养基获得菌丝体,试剂盒提取总RNA和cDNA;(2)目的基因的克隆:用合理引物PCR扩增出目的基因;(3)构建表达载体:以Ppic9k为载体,将目的基因插入启动子AOX1下游,5'和3'端酶切位点分别为EcoRⅠ,NotⅠ;(4)获取重组菌株:以bglⅠ为表达载体的线性化位点,实现表达载体线性化,电转,得到重组酵母;(5)重组菌株的诱导产酶:摇瓶发酵,用适当甲醇诱导产酶;(6)重组蛋白活性检测:利用SDS‑PAGE及刚果红‑CMC检测重组蛋白的表达量及活性。本方法构建的重组菌株能高效表达带his标签的蛋白,能得到高效单酶组分。

A method for construction of endoglucanase EG II, EG IV and EGV heterologously expressed in Pichia pastoris

【技术实现步骤摘要】
一种毕赤酵母中异源表达内切葡聚糖酶EGⅡ,EGⅣ,EGⅤ的构建方法
本专利技术涉及一种异源表达内切葡聚糖酶EGⅡ,EGⅣ,EGⅤ的重组毕赤酵母系统的构建,属于基因工程

技术介绍
木质纤维素生物质是地球上廉价且丰富的可再生资源,来源也广泛,包括常见的农作物秸秆、树木枝叶等。如果能实现木质纤维素的高效降解,通过生物转化来生产高附加值的产品,这将在一定程度上能够减少这类资源的浪费,这对于人类社会的可持续性发展具有积极的意义。传统纤维素酶的降解效率较低。传统纤维素酶由3类组成,即β-葡萄糖苷酶、内切葡聚糖酶以及外切葡聚糖酶。3类酶在纤维素水解过程中相互协同。但传统纤维素酶中只有外切葡聚糖酶能作用于难降解的纤维素结晶区,水解结晶纤维素。就目前工业应用最为广泛的产纤维素酶真菌里氏木霉而言,其纤维素酶系中缺乏外切酶和一葡萄糖普酶,导致其纤维素酶系酶解效率低下。所以,优化定制纤维素酶,使各组分达到最佳配比,才能在最少酶用量时获得最优的水解效果。因此,为了优化定制纤维素酶,获得纤维素酶单酶组分十分关键。近些年来,异源表达纤维素酶基因获得单酶组分是研究热点。可以实现翻译后修饰作用,如糖基化、二本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种毕赤酵母中异源表达内切葡聚糖酶EGⅡ,EGⅣ,EGⅤ蛋白的构建方法,包括以下步骤:(1)里氏木霉RNA和CDNA的获得:将里氏木霉QM9414培养,直至出绿色孢子,然后接种于固体诱导培养基(表面贴有玻璃纸)获得菌丝体,用试剂盒提取总RNA和反转录得到cDNA;(2)目的基因的克隆:设计合理引物,合适的条件,PCR扩增出EGⅡ,EGⅣ,EGⅤ的基因;(3)构建表达载体:以Ppic9k质粒为载体,将EGⅡ,EGⅣ,EGⅤ基因插入启动子AOX1下游,5'端酶切位点为EcoRⅠ,3'端酶切位点为NotⅠ,构建Ppic9k‑EGⅡ,EGⅣ,EGⅤ表达载体;(4)获取重组菌株:以bglⅠ为Ppic...

【技术特征摘要】
2018.09.26 CN 20181112760471.一种毕赤酵母中异源表达内切葡聚糖酶EGⅡ,EGⅣ,EGⅤ蛋白的构建方法,包括以下步骤:(1)里氏木霉RNA和CDNA的获得:将里氏木霉QM9414培养,直至出绿色孢子,然后接种于固体诱导培养基(表面贴有玻璃纸)获得菌丝体,用试剂盒提取总RNA和反转录得到cDNA;(2)目的基因的克隆:设计合理引物,合适的条件,PCR扩增出EGⅡ,EGⅣ,EGⅤ的基因;(3)构建表达载体:以Ppic9k质粒为载体,将EGⅡ,EGⅣ,EGⅤ基因插入启动子AOX1下游,5'端酶切位点为EcoRⅠ,3'端酶切位点为NotⅠ,构建Ppic9k-EGⅡ,EGⅣ,EGⅤ表达载体;(4)获取重组菌株:以bglⅠ为Ppic9k-EGⅡ,EGⅣ,EGⅤ表达载体的线性化位点,实现表达载体线性化,然后通过电转化转入毕赤酵母,得到EGⅡ,EGⅣ,EGⅤ的重组酵母;(5)重组菌株的诱导产酶:将筛选后的菌株,摇瓶发酵,加入适当甲醇诱导产酶;(6)重组蛋白活性检测:刚果红-CMC方法检...

【专利技术属性】
技术研发人员:钟成舒月力李栋梁
申请(专利权)人:天津科技大学
类型:发明
国别省市:天津,12

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