人源靶向补体抑制物蛋白mCR2-CD59及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种补体受体2变异体与补体抑制剂CD59的融合蛋白和所述融合蛋白在制备自身免疫性疾病治疗药物中的应用。所述补体受体2变异体是经过计算机模建、氨基酸置换后获得的分子改构体，比其野生序列有更高的配体结合与解离速率，具有更好的配体结合力。生物学分布实验证明，本发明专利技术提供的融合蛋白进入类风湿关节炎小鼠模型后可快速在关节炎部位高度聚集，具有显著的抗黏附/抗炎靶向抑制效应。在对MRL/lpr红斑狼疮小鼠的治疗中，所述融合蛋白能够显著提升小鼠的存活率，治疗组小鼠的蛋白尿、肾小球积分、间质炎症、血管炎和新月体/坏死等症状得到明显改善。

Human Targeted Complement Inhibitor Protein mCR2-CD59 and Its Application

【技术实现步骤摘要】
人源靶向补体抑制物蛋白mCR2-CD59及应用
本专利技术公开了一种融合蛋白，属于多肽

技术介绍
补体系统由30余种可溶性蛋白分子组成，是天然免疫系统的一部分，其组成成分包括补体固有成分、多种调节因子和补体受体等30多种分子。补体系统可通过3条既相对独立又相互联系的途径被激活，从而发挥调理吞噬、裂解细胞、介导炎症、免疫调节和清除免疫复合物等多种生物学效应，包括增强吞噬作用，增强吞噬细胞的趋化性，增加血管的通透性，中和病毒，细胞溶解作用，免疫反应的调节作用等。补体激活和其在靶结构上的沉积也可以间接地引起细胞或组织破坏，在补体途径中的各个点产生介导组织损害的补体激活产物。宿主组织上不适当的补体激活在许多自身免疫疾病和炎性疾病的病理学中起重要作用，并且也是造成与例如心肺炎症和移植排斥后的生物不相容性有关的许多病状的原因。补体抑制是治疗这些免疫介导的疾病和症状的潜在治疗方式。补体激活的途径有3个，即经典途径、旁路途径和甘露聚糖结合凝集途径。参与补体经典激活途径的成分包括C1-C9。按其在激活过程中的作用，人为地分成三组，即识别单位(Clq、Clr、Cls)、活化单位(C4、C2、C3)和膜攻击单位(C5-C9)，分别在激活的不同阶段即识别阶段、活化阶段和膜攻击阶段中发挥作用。这3个阶段一般在靶细胞膜的3个不同部位进行。补体在激活过程中C2、C3、C4、C5均分别裂解成2个或2个以上的片段，分别标以a、b等符号，如C3a、C3b、C3c等。其中C2b、C3b、C4b、C5b直接或间接结合在靶细胞上，以固相的形式参与溶细胞过程，C3a、C5a游离在液相。补体在激活过程中，C5、C6、C7经活化后还可聚合成C567，并与C3a、C5a一起发挥特殊的生物学功能。旁路激活途径与经典激活途径不同之处在于激活是越过了C1、C4、C2三种成分，直接激活C3继而完成C5至C9各成分的连锁反应，还在于激活物质并非抗原抗体复合物而是细菌的细胞壁成分—脂多糖，以及多糖、肽聚糖、磷壁酸和凝聚的IgA和IgG4等物质。旁路激活途径在细菌性感染早期，尚未产生特异性抗体时，即可发挥重要的抗感染作用。甘露聚糖结合凝集途径由血浆中甘露聚糖结合凝集素(Mannan-BindingLectin，MBL)直接识别多种病原微生物表面的N-氨基半乳糖或甘露糖，进而依次活化MASP-1、MASP-2、C4、C2、C3，形成和经典途径相同的C3与C5转化酶，激活补体级联酶促反应的活化途径。MBL激活途径的主要激活物为表面含有甘露糖基、岩藻糖和N-氨基半乳糖的病原微生物。以上三种途径均能产生C3转化酶，C3分子被C3转化酶裂解为过敏毒素C3a以及具有调理作用的C3b，C3b分子能与糖蛋白表面的胺基与羟基共价连接，这种共价作用由C3b分子内部的硫酯基所介导。因而，C3b分子可吸附于侵入体内的微生物表面，再与补体受体1(CR1/CD35)结合，在血清H因子和I因子的作用下水解形成iC3b，iC3b随后被裂解为C3d。C3d片段是补体C3的不能再酶解的最小片段。结合C3d分子的微生物能与II型补体受体(CR2/CD21)结合。补体激活产生的各种C3激活片段作为各种C3受体的配体起到补体调理素的作用。补体受体2(CR2)是其中的一种补体受体，作为一种跨膜蛋白，CR2通过在滤泡树突状细胞(FDC)、B细胞和一些T细胞上的表达并与免疫复合物的结合对于上述细胞尤其是成熟B细胞的存活以及高亲和力B细胞的选择起重要作用。CR2是C3结合蛋白家族的成员，并且由15-16个短共有重复(SCR)结构域(C3结合蛋白家族的特征性结构单元)组成，C3结合位点包含在2个N末端SCR中。不同于补体激活抑制剂(DAF，MCP，CR1和Crry)，CR2不是补体抑制剂，并且其不结合C3b。CR2的天然配体是iC3b，C3dg和C3d，其是结合CR2两个N末端SCR结构域的C3b的细胞结合裂解片段。C3的裂解最初引起C3b的产生及其在激活细胞表面上的沉积。C3b片段参与酶复合物的产生，该酶复合物扩大补体级联。在细胞表面上，特别是当在含有补体激活调节剂的宿主表面(即，大多数宿主组织)上沉积C3b时，C3b快速转化为失活的iC3b。即使在不存在膜结合的补体调节剂的情况下，也形成相当高水平的iC3b。随后，iC3b被血清蛋白酶消化为膜结合片段C3dg和C3d，但是这个过程相对慢。因此，CR2的C3激活片段配体一旦产生后就相对长寿，并且以高浓度存在于补体激活位点。CR2因此能充当将效应分子带到补体激活位点的有效靶向载体。补体激活的下调已经在动物模型和体外研究中被证实对于治疗几种疾病适应症是有效的，例如系统性红斑狼疮和肾小球肾炎、类风湿性关节炎、心肺分流和血液透析、器官移植中的超急性排斥、心肌梗塞、再灌注损伤以及成人呼吸窘迫综合症。此外，其它炎症状况和自身免疫病/免疫复合物病也与补体激活紧密相关，包括热损伤、重症哮喘、过敏性休克、肠炎、风疹、血管性水肿、血管炎、多发性硬化症、重症肌无力、膜增殖性肾小球肾炎和干燥综合症。已有研究证明存在两大类的膜补体抑制剂：补体激活途径的抑制剂(抑制C3转化酶形成)和终末补体途径的抑制剂(抑制MAC形成)。补体激活的膜抑制剂包括补体受体1(CR1)，衰变加速因子(DAF)和膜辅因子蛋白(MCP)，这些抑制剂在补体级联的更早期起作用。CD59是一种终末补体途径的抑制剂，其最初分离自人红细胞表面，是分子量为18-20kDa的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的膜糖蛋白。与以上在补体级联的更早期起作用不同的是，CD59通过形成膜攻击复合物(MAC)来进行补体激活后抑制的。MAC形成是补体级联的最终事件之一，在细胞膜上形成小孔，这最终导致细胞的破坏。CD59结合C5b-8，干扰C9分子的后续聚合和MAC形成，从而达到防止补体级联活化导致的自体组织损伤的效果。研究表明，未被靶向的CD59只有非常弱的补体抑制活性(SONGH，etalJClinInvest111:1875-1885)，将补体抑制剂靶向补体激活和疾病位点则成为充分发挥CD59补体抑制的有效方法。因为补体在宿主防御和免疫复合物分解代谢中起重要的作用，所以定向的补体抑制剂也可以减少特别是长期补体抑制带来的潜在严重的副作用。在体外可行性研究中，已证明与保护未靶向细胞相比，抗体-DAF和抗体-CD59融合蛋白更有效地保护靶向的细胞免受补体的破坏。鉴于CD59是一种终末补体途径的抑制剂，可以说是补体激活抑制的最后关隘，因此无论其单独发挥抑制作用还是和其它阶段的抑制剂联合发挥抑制作用，在临床应用上都具有重要的意义。CN100594037C分别报道了补体靶向因子补体受体2与补体抑制剂DAF和CD59融合对于抑制补体激活的有益效果。但是补体受体2与CD59融合蛋白在抑制补体活性的发挥上还存在着一定的技术问题，例如，在与补体受体2与DAF融合蛋白的对比中其抑制活性不高，而且CR2与CD59补体不同的融合方向也明显影响了CD59的抑制活性。现有技术出现的问题提示融合蛋白的序列乃至空间构象是影响补体抑制剂充分发挥活性的一个关键因素。因此对融合蛋白的改构尤其是对靶向因子CR2的改构以提高靶向效率降低非靶向损害就成为一种新的改进思本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种补体受体2变异体与CD59的融合蛋白，其特征在于，所述补体受体2变异体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。

【技术特征摘要】
1.一种补体受体2变异体与CD59的融合蛋白，其特征在于，所述补体受体2变异体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所述。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述补体受体2变异体与CD59分子以柔性短肽SGGGGS连接。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所述。4.一种编码权利要求3所述融合蛋白的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子的序列如SEQIDNO.4所述。5.一种含有权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐晓敏，杜兰英，
申请(专利权)人：北京康普美特创新医药科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：北京,11