一种基于菌丝球结构调控的纳他霉素合成工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种基于菌丝球结构调控的纳他霉素合成工艺，具体是在纳他霉素发酵种子预培养阶段中，利用惰性微粒与产生菌菌丝球之间的碰撞作用，以缩小菌丝球的直径，降低菌丝球的致密程度，并将以上菌丝球结构受到改造的发酵种子用于纳他霉素发酵，从而提高纳他霉素的生物合成水平。利用本发明专利技术的发酵种子菌丝球调控方法，培养褐黄孢链霉菌发酵生产纳他霉素，可使得发酵产量大幅提高，发酵时间缩短，显著提升发酵生产的生产强度。

Synthesis of Natamycin Based on Structure Regulation of Mycelium Spheres

【技术实现步骤摘要】
一种基于菌丝球结构调控的纳他霉素合成工艺
本专利技术涉及一种基于发酵种子菌丝球结构调控的纳他霉素合成工艺，即采用外源添加惰性微粒的方式来在发酵种子预培养阶段中调控菌丝球结构，从而促进纳他霉素的生物合成，属于工业生物

技术介绍
纳他霉素是一种多烯大环内酯类的抗真菌剂，其不仅可强效抑制霉菌和酵母的生长，还可有效防止真菌毒素的产生。纳他霉素已被美国食品药品管理局(FDA)认定为“总体安全的”(GRAS)化合物，具有极大的潜在应用价值。相对其他抗生素产品，纳他霉素不会产生抗药性，且安全、无毒，因此纳他霉素可广泛应用于抗真菌治疗、食品绿色防腐等方面。纳他霉素是一种链霉菌属发酵合成的次级代谢产物，目前其发酵产量较低，这直接推高了其市场价格(800-900元/公斤)。要降低纳他霉素应用的成本和市场化阻力，提高其发酵合成水平至为关键。近年来学术界和产业界在提升那他霉素的生物合成水平上进行了大量研究，包括选育纳他霉素高产菌、筛选最优发酵培养基、优化发酵工艺等。尽管以上研究最终提高了纳他霉素的发酵水平，但是，在“液态发酵中菌丝球结构如何影响纳他霉素合成”，以及“如何对发酵中菌丝球结构进行调控”的问题上，相关的研究极少。目前，纳他霉素产生菌主要有恰塔努加链霉菌、褐黄孢链霉菌、利迪链霉菌、纳塔尔链霉菌，其中，我国工业生产主要依靠褐黄孢链霉菌。以上纳他霉素产生菌均为链霉菌属，其共同特点在于在液态发酵中呈细丝状，在发酵搅拌的作用下菌丝会发生相互缠绕，从而形成不同结构大小的菌丝球。事实上，丝状菌的菌丝球结构大小与其代谢产物合成之间的关系极为紧密。例如，在博来霉素生物合成中，细长、分散且表面具有短菌丝的Amycolatopsisbalhimycina菌丝球更有利于其产物的合成；同样，在ε-聚赖氨酸发酵中，细小的Streptomycesalbulus菌丝球有助于提高传质和传氧效率，从而在前体和能量供应层面保障产物的合成；此外，在真菌多糖合成中，降低其菌丝球的直径能大幅提高Grifolafrondosa的生物量及其多糖合成关键酶的活性，进而促进其真菌多糖的合成。微生物大规模发酵常常需要培养液体发酵种子的预培养，种子液中菌体的生理特性以及细胞活力对后期发酵的影响极大。目前纳他霉素发酵领域的大部分工作均集中于发酵过程的调控以及营养条件的优化，在发酵种子液预培养上的研究极少。专利技术人前期研究发现，种子预培养阶段中菌丝球直径过大将导致后期纳他霉素发酵水平降低。“如何在种子培养阶段对链霉菌菌丝球结构进行调控”无疑成为了纳他霉素生物发酵中的一个重要问题。惰性微粒是一类在发酵中不与培养基和微生物发生化学反应的微小颗粒，其粒径介于4-400μm范围。添加在发酵液中的惰性微粒能够在高速搅拌下与菌丝球进行无数次碰撞，从而改变菌丝球的大小和结构，进而改善其中丝状菌的传质传氧效果。目前，惰性微粒的添加在Grifolafrondosa发酵合成多糖，以及Streptomycesalbulus发酵合成ε-多聚赖氨酸方面有着成功的应用。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种基于菌丝球结构调控的纳他霉素合成方法，通过外源添加惰性微粒的方式，在种子预培养阶段中对菌丝球的结构进行调控，进而在后期发酵阶段中显著促进纳他霉素的生物合成，提高发酵终产量。专利技术人前期研究发现，纳他霉素发酵种子预培养中若出现较大颗粒的菌丝球，后期产物发酵水平将大幅降低，而小菌丝球结构有利于纳他霉素的生物合成。为进一步提高纳他霉素发酵水平，本专利技术借助惰性微粒外源添加的手段，在纳他霉素发酵种子预培养阶段中人工干预菌丝球的结构，主要在于降低菌丝球直径，提高菌丝球的松散程度，由此在后期发酵中提升纳他霉素的生物合成水平。本专利技术方法能稳定获得活性更强的纳他霉素发酵种子液，从而大幅提升后期纳他霉素的发酵产量，在纳他霉素生物合成产业中具有重要的工业应用价值。本专利技术基于菌丝球结构调控的纳他霉素合成工艺，是在纳他霉素发酵种子预培养阶段中，利用惰性微粒与产生菌菌丝球之间的碰撞作用，以缩小菌丝球的直径，降低菌丝球的致密程度，并将以上菌丝球结构受到改造的发酵种子用于纳他霉素发酵，从而提高纳他霉素的生物合成水平。本专利技术适用于1个月内菌龄的斜面孢子，当斜面孢子较年轻时(8天)，种子阶段进行菌球结构调控，最终发酵45h纳他霉素产量为3.8g/L，相比未进行调控的发酵组，产量提高了40.7％，发酵时间缩短了19.6％，发酵生产强度提升了75％；当斜面孢子较老时(28天)，种子阶段进行菌球结构调控，最终发酵57h纳他霉素产量为2.6g/L，相比未进行调控的发酵组，纳他霉素产量提高了116.7％，发酵时间缩短了33.7％，发酵生产强度提升了228.6％；本方法可有效提升发酵中的生产强度，在工业微生物发酵领域具有较强的应用价值。本专利技术基于菌丝球结构调控的纳他霉素合成工艺，采用分批发酵的方式，具体包括如下步骤：步骤1：斜面孢子的培养将褐黄孢链霉菌接种于固体贝塔纳培养基斜面上，于29℃恒温培养箱中培养直至产生褐黄色孢子；用接种环挑取3环孢子置于装有60mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，液体种子培养基中预添加一定量的惰性微粒，于29℃、220rpm条件下恒温振荡培养2天；步骤2：分批发酵在5L发酵罐中加入3L纳他霉素发酵培养基，于高温灭菌锅中115-121℃灭菌20-30min，其中葡萄糖单独灭菌；随后，以8％的接种量接种步骤1获得的发酵种子，于初始pH值7.2、温度29℃、溶氧保持在30％以上的培养条件下发酵，直至葡萄糖消耗殆尽；发酵pH值采用自动流加NaOH溶液的方式控制pH值为7.0直至分批发酵结束。步骤1中，所述褐黄孢链霉菌为褐黄孢链霉菌Z8(StreptomycesgilvosporeusZ8)。步骤1中，所述固体贝塔纳培养基的配方以1L计，包括如下：葡萄糖10g，酵母粉1g，蛋白胨2g，琼脂20g，pH7.5。步骤1中，所述液体种子培养基的配方以1L计，包括如下：葡萄糖20g，酵母粉6g，大豆蛋白胨6g，NaCl5g，pH7.5。步骤1中，所述惰性微粒为玻璃珠(2mm)、石英砂(40目、70目)或6μm滑石粉；其中玻璃珠(2mm)添加范围在5-35个/30mL，40目石英砂添加范围在1-7g/L，70目石英砂添加范围在1-7g/L，6μm滑石粉添加范围在1-7g/L；优选滑石粉，添加量为3-4g/L。步骤2中，所述纳他霉素发酵培养基的配方以1L计，包括如下：葡萄糖80g，酵母粉10g，大豆蛋白胨20g，NaCl5g，pH7.5。与传统纳他霉素发酵生产方法相比，本专利技术采用种子培养阶段菌丝球结构调控的手段发酵生产纳他霉素具有以下优点：1、能显著提升纳他霉素分批发酵产量，缩短分批发酵时间，提高生产强度；2、适用范围广，对1个月内菌龄的斜面孢子均有效，尤其对菌龄较老的斜面孢子效果显著，可提升菌种在发酵阶段的生产性能，提高纳他霉素发酵水平。具体实施方式下面结合具体实施例，可以更好地理解本专利技术。实施例所描述的具体的发酵种子培养规律、惰性微粒筛选、工艺条件以及结果仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权力要求书中所详细描述的本专利技术。本专利技术的生物反应器包括250mL三角瓶和5L液态发酵罐两种。本专利技术惰性微粒筛选实验均在250mL三角瓶中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于菌丝球结构调控的纳他霉素合成工艺，其特征在于：在纳他霉素发酵种子预培养阶段中，利用惰性微粒与产生菌菌丝球之间的碰撞作用，以缩小菌丝球的直径，降低菌丝球的致密程度，并将以上菌丝球结构受到改造的发酵种子用于纳他霉素发酵，从而提高纳他霉素的生物合成水平。

【技术特征摘要】
1.一种基于菌丝球结构调控的纳他霉素合成工艺，其特征在于：在纳他霉素发酵种子预培养阶段中，利用惰性微粒与产生菌菌丝球之间的碰撞作用，以缩小菌丝球的直径，降低菌丝球的致密程度，并将以上菌丝球结构受到改造的发酵种子用于纳他霉素发酵，从而提高纳他霉素的生物合成水平。2.根据权利要求1所述的合成工艺，采用分批发酵的方式，其特征在于包括如下步骤：步骤1：斜面孢子的培养将褐黄孢链霉菌接种于固体贝塔纳培养基斜面上，于29℃恒温培养箱中培养直至产生褐黄色孢子；用接种环挑取3环孢子置于装有60mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，液体种子培养基中预添加一定量的惰性微粒，于29℃、220rpm条件下恒温振荡培养2天；步骤2：分批发酵在5L发酵罐中加入3L纳他霉素发酵培养基，于高温灭菌锅中115-121℃灭菌20-30min，其中葡萄糖单独灭菌；随后，以8％的接种量接种步骤1获得的发酵种子，于初始pH值7.2、温度29℃、溶氧保持在30％以上的培养条件下发酵，直至葡萄糖消耗殆尽；发酵pH值采用自动流加NaOH溶液的方式控制pH值为7.0直至分批发酵结束。3.根据权利要求2所述的合成工艺，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾昕，李峰，曾化伟，徐大勇，张标，信丙越，李珊珊，
申请(专利权)人：淮北师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34