电势型生物传感器和检测方法技术

本发明专利技术提供一种检测样品中尿素浓度的电势型生物传感器和方法，该电势型生物传感器含有指示电极和参比电极，指示电极上的第二反应试剂包括脲酶但不包括电子传递体，而参比电极上的第一反应试剂包括电子传递体但不含有脲酶。在不施加外部电压的情形下，加入血液等样品后，脲酶催化样品中的尿素发生反应，从而导致指示电极和参比电极之间产生电势差，而且指示电极与参比电极之间的电势差与样品中的尿素浓度成线性关系，根据这种线性关系，就可计算出样品中的尿素浓度。

【技术实现步骤摘要】
电势型生物传感器和检测方法
本专利技术涉及用于检测样品中尿素浓度的电势型生物传感器和方法，属于电分析化学检测

技术介绍
尿素(urea)是蛋白及其组成成份氨基酸分解代谢的最终产物，不与血浆蛋白结合。在蛋白分解代谢中，蛋白被分解为氨基酸，氨基酸经脱氨基作用形成的氨在肝脏中进入尿素循环与二氧化碳产生尿素。肝脏中产生的尿素主要经肾脏排泄，小部分经汗液排出。在肾脏中，尿素经过肾小球滤过，并随尿液排出体外。如果肾脏功能遭受损伤，那么肾小球滤过率降低，血液中的尿素浓度就会增加。因此，血液中的尿素含量是评估肾功能最为重要的生理指标之一，用于诊断某些肾脏疾病和代谢紊乱疾病。尿素测定是肾功能评价应用最广的实验，它经常和肌酐联合使用来诊断肾前性高尿素血症(心脏代偿失调、脱水、蛋白分解增加)、肾性高尿素血症(肾小球肾炎、慢性肾炎、多囊肾、肾硬化和肾小管坏死)和肾后性高尿素血症(尿路梗阻)。早期的尿素测定方法大多为比色法，如先用脲酶将尿素分解为NH4+和HCO3-，随后根据波氏反应在560nm波长下检测产生的蓝色吲哚酚的吸光度，利用谷氨酸脱氢酶在340nm波长下检测吸光度下降速率，或者利用二乙酰一肟直接与尿素发生缩合反应，在525nm下检测产生的红色二嗪衍生物的吸光度。但是比色法需要使用昂贵的仪器和专业的技术人士，而且操作繁琐，不能够快速地测定出结果，此外，血液中存在内源性干扰物也影响检测结果的准确性。为此，美国专利US5063081A和US7540948B2均采用基于指示电极和参比电极的电势测定法来检测血液中的尿素氮含量(即血液尿素中的氮含量，与血液中的尿素浓度存在着一种确定的换算关系)：指示电极由位于顶部的脲酶层(含有足够的脲酶)、位于底部的金属/金属盐导电层以及位于两者之间的膜层组成，其中这种膜层含有NH4+选择性离子载体，如无活菌素(nonactin)和恩镰孢菌素(enniatin)等。当加入血液时，脲酶与血液中的尿素发生反应，从而产生NH4+、HCO3-和OH-，仅NH4+能够通过NH4+选择性离子载体穿过这种膜层，从而导致膜层两侧产生电势差；最后通过测量指示电极和参比电极之间的电势差，来计算样品中的尿素氮含量。然而，这两篇美国专利中的这种电位测量法也存在着明显的不足之处：NH4+选择性离子载体成本昂贵；根据能斯特方程，在一定的条件下，指示电极和参比电极之间的电势差与血液中的尿素浓度对数成线性关系，依据这一点来计算血液中的尿素浓度，这会导致血液中的尿素浓度计算方法比较复杂；指示电极的结构比较复杂，制造起来较为困难。此外，中国专利申请CN201310308122.2提供一种脲酶电极法检测尿素氮的试剂，但是它的检测原理是基于电势与溶液中给定离子活动度的对数的线性关系，测定溶液中离子的浓度，然后计算出溶液中的尿素氮含量。这种计算方法比较复杂。此外，由于涉及利用脲酶电极计算溶液中的给定离子浓度，因此检测结果容易受到溶液中其他离子的干扰。
技术实现思路
针对现有技术的不足之处，本专利技术提供一种电势型生物传感器，该电势型生物传感器含有指示电极和参比电极，指示电极不含有NH4+选择性离子载体，参比电极上的第一反应试剂包括钌化合物(如三氯化六铵合钌)但不包含脲酶，而指示电极上的第二反应试剂包括脲酶但不包括钌化合物。令人意料之外的是，在不施加外部电压的情形下，加入血液等样品后，脲酶催化样品中的尿素发生反应，从而导致指示电极和参比电极之间产生电势差，而且指示电极与参比电极之间的电势差与样品中的尿素浓度成线性关系。本专利技术的目的在于提供一种电势型生物传感器，具有一个加样端和一个电连接端，所述电势型生物传感器包括绝缘基底、导电层、反应区域形成层、通道形成层和上盖层；所述导电层设置在所述绝缘基底上，包括位于所述电连接端的第一触点和第二触点、位于所述加样端的一个指示电极和一个参比电极、将所述参比电极和所述第一触点连接在一起的第一导电迹线以及将所述指示电极和所述第二触点连接在一起的第二导电迹线；所述反应区域形成层覆盖在所述电极系统上，具有分隔开的第一反应孔和第二反应孔，所述第一反应孔暴露所述参比电极的至少一部分区域并在所述参比电极上形成第一反应区域，所述第二反应孔暴露所述指示电极的至少一部分区域并在所述指示电极上形成第二反应区域；所述通道形成层设置在所述反应区域形成层上，在所述加样端上设置一个开口，所述开口同时暴露所述第一反应区域的至少一部分区域和所述第二反应区域的至少一部分区域；所述上盖层设置在所述通道形成层上，具有一个通气孔，所述上盖层与所述开口、所述反应区域形成层和所述绝缘基板一起形成一个样品通道，所述通气孔位于所述样品通道的上方，一个加样口设置在所述加样端中，样品通过所述加样口进入所述样品通道；第一反应试剂位于所述第一反应区域上，含有电子传递体但不含有脲酶，第二反应试剂位于所述第二反应区域上，含有脲酶但不含有电子传递体。进一步地，所述反应区域形成层是通过丝网印刷方法将疏水性的绝缘材料印在所述绝缘基板上形成的，在进行丝网印刷时，所述绝缘基板的部分区域不印刷绝缘材料，从而在所述反应区域形成层上产生分隔开的所述第一反应孔和所述第二反应孔。进一步地，所述开口的宽度为1.0～2.5mm，所述第二反应区域和所述第一反应区域的宽度大约为所述开口宽度的2～3倍。进一步地，所述第一反应试剂和第二反应试剂还含有聚合物粘合剂、表面活性剂、缓冲剂和稳定剂；所述聚合物粘合剂为纤维素衍生物，其浓度为0.01～10％(W/W)；所述表面活性剂选自PEG系列表面活性剂、Tween系列表面活性剂、胆酸钠、CHAP、TritonX-100和十六烷基胆碱，其浓度0.01％～5％(W/W)；所述缓冲剂选自柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液；所述稳定剂选自糖类物质、糖醇类物质、氨基酸、蛋白和含羧基有机酸，其浓度为0.1％～50％。进一步地，所述电子传递体选自钌化合物、铁氰化钾或亚铁氰化钾。进一步地，所述电子传递体的浓度为1.0～4.5％(w/w)。进一步地，所述电子传递体为钌化合物；所述钌化合物的浓度为1.0～4.5％(w/w)。进一步地，所述脲酶浓度为2280U/mL～8712U/mL。进一步地，在所述参比电极和所述指示电极的一侧或两侧设置至少一个辅助扩散组件；在所述参比电极的一侧或两侧设置的每个辅助扩散组件部分地覆盖着所述第一反应区域，在所述指示电极的一侧或两侧设置的每个辅助扩散组件部分地覆盖着所述第二反应区域。进一步地，所述辅助扩散组件是由导电的碳油墨制造出来的多孔材料。进一步地，与所述参比电极的两个相对侧边中的任意一个侧边距离最近的一个辅助扩散组件与所述参比电极之间的间隔距离以及与所述指示电极的两个相对侧边中的任意一个侧边距离最近的一个辅助扩散组件与所述指示电极之间的间隔距离均为0.1～0.5mm。本专利技术的目的还在于提供一种检测样品中尿素浓度的方法，提供电势型生物传感器，具有一个加样端和一个电连接端，电势型生物传感器包括位于电连接端的第一触点和第二触点，包括加样端的一个指示电极和一个参比电极，所述反应试剂包括位于所述参比电极上的第一反应试剂和位于所述指示电极上的第二反应试剂，所述第一反应试剂含有电子传递体但不含有脲酶，所述第二反应试剂含有脲酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种电势型生物传感器，具有一个加样端和一个电连接端，其特征在于，所述电势型生物传感器包括绝缘基底、导电层、反应区域形成层、通道形成层和上盖层；所述导电层设置在所述绝缘基底上，包括位于所述电连接端的第一触点和第二触点、位于所述加样端的一个指示电极和一个参比电极、将所述参比电极和所述第一触点连接在一起的第一导电迹线以及将所述指示电极和所述第二触点连接在一起的第二导电迹线；所述反应区域形成层覆盖在所述电极系统上，具有分隔开的第一反应孔和第二反应孔，所述第一反应孔暴露所述参比电极的至少一部分区域并在所述参比电极上形成第一反应区域，所述第二反应孔暴露所述指示电极的至少一部分区域并在所述指示电极上形成第二反应区域；所述通道形成层设置在所述反应区域形成层上，在所述加样端上设置一个开口，所述开口同时暴露所述第一反应区域的至少一部分区域和所述第二反应区域的至少一部分区域；所述上盖层设置在所述通道形成层上，具有一个通气孔，所述上盖层与所述开口、所述反应区域形成层和所述绝缘基板一起形成一个样品通道，所述通气孔位于所述样品通道的上方，一个加样口设置在所述加样端中，样品通过所述加样口进入所述样品通道；第一反应试剂位于所述第一反应区域上，含有电子传递体但不含有脲酶，第二反应试剂位于所述第二反应区域上，含有脲酶但不含有电子传递体。...

【技术特征摘要】
1.一种电势型生物传感器，具有一个加样端和一个电连接端，其特征在于，所述电势型生物传感器包括绝缘基底、导电层、反应区域形成层、通道形成层和上盖层；所述导电层设置在所述绝缘基底上，包括位于所述电连接端的第一触点和第二触点、位于所述加样端的一个指示电极和一个参比电极、将所述参比电极和所述第一触点连接在一起的第一导电迹线以及将所述指示电极和所述第二触点连接在一起的第二导电迹线；所述反应区域形成层覆盖在所述电极系统上，具有分隔开的第一反应孔和第二反应孔，所述第一反应孔暴露所述参比电极的至少一部分区域并在所述参比电极上形成第一反应区域，所述第二反应孔暴露所述指示电极的至少一部分区域并在所述指示电极上形成第二反应区域；所述通道形成层设置在所述反应区域形成层上，在所述加样端上设置一个开口，所述开口同时暴露所述第一反应区域的至少一部分区域和所述第二反应区域的至少一部分区域；所述上盖层设置在所述通道形成层上，具有一个通气孔，所述上盖层与所述开口、所述反应区域形成层和所述绝缘基板一起形成一个样品通道，所述通气孔位于所述样品通道的上方，一个加样口设置在所述加样端中，样品通过所述加样口进入所述样品通道；第一反应试剂位于所述第一反应区域上，含有电子传递体但不含有脲酶，第二反应试剂位于所述第二反应区域上，含有脲酶但不含有电子传递体。2.根据权利要求1所述的电势型生物传感器，其特征在于，所述反应区域形成层是通过丝网印刷方法将疏水性的绝缘材料印在所述绝缘基板上形成的，在进行丝网印刷时，所述绝缘基板的部分区域不印刷绝缘材料，从而在所述反应区域形成层上产生分隔开的所述第一反应孔和所述第二反应孔。3.根据权利要求1所述的电势型生物传感器，其特征在于，通道形成层的开口的宽度为1.0～2.5mm，所述第二反应区域和所述第一...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙玉龙，项新亮，程艳，张莉，
申请(专利权)人：利多香港有限公司，
类型：发明
国别省市：中国香港,81